康复新液对光老化HaCaT细胞保护作用的研究

王雄 黄艳丽 钱丽洁

[摘要]目的：观察康复新液对中波紫外线（UVB）照射损伤后皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）的影响，初步探讨其作用机制。方法：采用UVB辐射HaCaT细胞进行造模，分为空白组、模型组、药物组。空白组不给予处理，模型组、药物组分别予不同剂量UVB辐射，药物组在模型组基础上给予康复新液。以CCK8法测定细胞增殖活力，酶生化法测定过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶含量。结果：与模型组比较，同等UVB剂量下药物组乳酸脱氢酶含量下降（P<0.01），超氧化物歧化酶含量及细胞增殖活力升高（P<0.01）。结论：康复新液可通过减轻UVB对HaCaT细胞氧化应激性损伤，从而达到对HaCaT细胞的保护作用。

[关键词]康复新液；中波紫外线；皮肤角质形成细胞；保护作用；光老化；超氧化物歧化酶

[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）11-0145-03

Abstract： Objective To observe the protective effect of Kangfuxin Solution on photoaging Human Keratinocytes （HaCaT cells） induced by ultraviolet radiation B （UVB）， and explore its underlying mechanism. Methods The models of photoaging HaCaT cell were established by UVB radiation， which were divided into blank group， model group and drug group， respectively.The blank group was not treated， the model group and the drug group were given different doses of UVB radiation， while the drug group was given the kangfuxinye on the basis of the model group， and then the cell proliferation activity was measured by CCK8. The contents of catalase， superoxide dismutase and lactate dehydrogenase were measured by enzyme biochemical method. Results Compared with the model group of the same UVB dose， the level of lactate dehydrogenase in the drug group was lower（P<0.01）， while the contents of superoxide dismutase， catalase and cell proliferation increased （P<0.01）. Conclusion Kangfuxin Solution has the protective effect on HaCaT cells by inhibiting the damage of UVB to HaCaT cells.

Key words： kangfuxinye； UVB； HaCaT cells； protective effect； light aging； superoxide dismutase

康復新液主要组分为美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物，有去腐生肌，改善创面微循环，消除炎症水肿和增强机体免疫等作用[1-2]，其抗氧化作用可提高淋巴细胞及血清溶菌酶的活性，使体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）值上升，调节机体的生理平衡[3-4]。但尚未见抗皮肤角质细胞紫外线损伤的相关报道。

本实验在体外培养永生化人表皮角质形成细胞（HaCaT细胞），以不同剂量中波紫外线（ultraviolet light in medium waves， UVB）照射建立细胞模型，观察康复新液对UVB损伤光老化HaCaT细胞的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器：本试验主要试剂有：康复新液（湖南科伦制药有限公司，国药批号Z43020995）；HaCaT细胞（武汉大学中国典型培养物保藏中心）；DMEM培养液（Gibco公司）；胎牛血清（Bovogen公司）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；PBS（Hyclone公司）；CCK8（Cell Counting Kit-8，日本同仁公司）；SOD试剂盒、过氧化物酶（Catalase，CAT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物科技）。主要实验仪器：UVB光疗仪（Sigma公司）、倒置显微镜（日本Olympus）、超净工作台、二氧化碳培养箱和酶标仪等（Bio-Rad公司）。

1.2 HaCaT细胞培养：HaCaT细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置CO2培养箱（培养条件5% CO2、饱和湿度、37℃）中培养。

1.3 UVB诱导细胞老化：参考相关文献建立细胞光老化模型[5-6]：UVB照射前1d对细胞进行传代，使其汇合度为50%～70%。照射前将培养液吸去，PBS缓冲液冲洗1次，再加入少量PBS缓冲液覆盖照射细胞上层，以UVB光源照射。

1.4 分组及干预处理：实验分为空白、模型组、药物组。空白组：HaCaT细胞不给予康复新液，同时也不进行UVB照射；模型组：HaCaT细胞仅进行UVB照射，照射剂量分别为10mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2；药物组：细胞经UVB照射处理后再加入康复新液。照射完后，吸弃PBS，加入培养液继续培养24h，获细胞培养上清或细胞，用于后续实验。

1.5 CCK-8检测细胞增殖活性：将HaCaT细胞以5×104个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，按1.4分组干预方法处理细胞。细胞培养24h后，每孔加入CCK-8溶液10?1，置于37℃，5% CO2培养箱中避光孵育，孵育4h后在酶标仪上于450nm波长处测定各孔的吸光度值。实验均重复3次，每样本设3个复孔，结果取平均值。计算细胞存活率公式为：（A药物组-A空白组）/（A模型组-A空白组）×100%。

1.6 LDH、SOD活性及CAT含量检测：HaCaT细胞以1×106个/孔接种96孔板，待细胞贴壁后，按1.4分组干预方法处理细胞。细胞培养24h后，收集上清液检测LDH含量，收集细胞检测CAT、SOD和CAT含量。实验重复3次，每样本设3个复孔。

1.7 统计学方法：采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。实验数据以（x?±s）表示，组间差异采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量UVB对HaCaT细胞LDH、SOD、CAT及增殖率影响：UVB剂量为0即为空白组，与空白组相比，随着UVB照射强度增加，模型组HaCaT细胞增殖率逐渐降低（P<0.01），细胞SOD及CAT活性逐渐降低，LDH含量逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 康复新液对不同剂量光损伤HaCaT细胞的作用：与模型组同等UVB辐射剂量下相关指标比较（见表1），药物组LDH含量下降（P<0.05），SOD、CAT含量及细胞增殖活力升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

光老化是由于皮肤暴露于UV下而造成的慢性损伤，主要涉及UV诱导活性氧簇产生、蛋白激酶信号通路活化、金属蛋白酶类表达以及加重炎症反应等，使表皮异常增生、真皮胶原结构改变、炎症细胞浸润，临床表现为皮肤干燥松弛、皱纹深而多、弹性下降以及色素沉着等[7]，不仅有损皮肤美容，与部分皮肤癌变疾病也有密切关系。目前对皮肤衰老的研究主要是对皮肤成纤维细胞和角质形成细胞衰老的研究。

波长290～320nm的UVB主要作用于表皮，使角质形成细胞产生大量ROS，诱发氧化反应，导致SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶含量下降，其产物丙二醛、LDH含量增加，导致更多ROS的产生，以正反馈形式加剧皮肤组织和细胞的损伤。正常情况下，细胞内存在一系列抗过氧化物酶，可以清除细胞内产生的ROS，当细胞内ROS生成增加、清除能力下降和抗氧化能力减弱时可致细胞氧化损伤[8-9] 。国内外评价皮肤光老化的客观标准主要是检测衰老皮肤与正常皮肤中的与氧化相关物质（包括测定SOD、GSH-Px、LDH、CAT、GSH含量和MDA水平）是否存在差异[10-11]。当细胞膜受氧化攻击受损时，LDH可能通过细胞膜渗出，间接反应细胞氧化应激受损程度。

康复新液是提取美洲大蠊体内的活性物质而成，主要成分为多元醇类及肽类活性物质，含有18种氨基酸，能够去腐生肌、改善微循环，消除炎症、水肿和增强机体免疫等作用[4]，还有促进机体的新陈代谢，抗氧化、清除自由基，抗衰老作用[12-13]。

本次实验对比空白组和模型组发现随着UVB照射强度增加，HaCaT细胞增殖率逐渐降低，细胞SOD及CAT活性逐渐降低、LDH含量逐渐增加，本次实验光老化模型建立成功。当实验加入康复新液后，对比同等UVB剂量下的模型组，发现SOD及CAT活性明显提高，LDH含量降低，UVB对HaCaT细胞增殖抑制作用减轻，细胞存活率提高。说明康复新液可以对抗UVB对HaCaT细胞膜损伤，保护细胞膜完整性。因此，笔者推测康复新液保护角质形成细胞，促进细胞增殖的作用与其抗氧化、清除自由基有关。

本实验初步证实康复新液对3种不同剂量UVB照射HaCaT細胞损伤的保护作用，康复新液通过提高细胞中SOD、CAT的活性，降低了LDH漏出量，从而达到抗皮肤光老化的作用，关于不同浓度康复新液对光损伤细胞的保护作用及其具体分子机制，将在后续实验中做进一步研究。

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[收稿日期]2018-08-15 [修回日期]2018-11-01

编辑/贾敏