某猪场猪流行性腹泻病的病原检测

2018-01-17胡宏伟余丽花樊延明李志赛肖啸代飞燕

四川畜牧兽医 2018年1期

胡宏伟，余丽花，樊延明，李志赛，肖啸，代飞燕

（1.云南省易门县动物卫生监督所，云南易门 651100；2.云南省香格里拉市动物卫生监督所，云南香格里拉 674400；3.云南省华坪县通达乡农业综合服务中心，云南华坪 674800；4.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；5.云南农业大学动物医院，云南昆明 650031）

猪流行性腹泻是一种由猪流行性病毒引起的急性、高度接触性肠道传染病[1]，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科冠状病毒属的一员。发病猪是本病的主要传染源，病毒主要分布在肠系膜淋巴结和小肠绒毛上皮细胞，随粪便排出后通过污染环境中的饲料、饮用水及生产设备等进行传播[2]。一周龄仔猪腹泻达3～4d，表现为严重脱水，死亡率达50%，最高为100%[3]。近年从中国分离到的CV777毒株是该病毒的一个新基因型[4]。

1 材料与方法

1.1 试验动物从山东夏津县某猪场随机选择10头未经治疗的流行性腹泻病死仔猪。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫胶体金层析试纸检测取免疫胶体金检测试纸，在吸附孔中加入病死仔猪的肠内容物样品，吸附3min，即可获得免疫胶体金层析试纸的检测结果。

1.2.2 荧光定量PCR检测

1.2.2.1 检测样品猪场里腹泻症状明显的哺乳仔猪小肠内容物，环境取样棉拭子及料线中的母猪饲料样品。小肠内容物取样：用消毒棉线结扎一段小肠的两端，用火焰灼烧后的刀片在结扎端外侧割断肠管。从采集的10份病猪肠道内容物中随机抽取4份进行检测，从5份料线样品和5份环境样品中分别抽取2份进行检测。

待检病料处理：用0.01mol/L磷酸缓冲液将病料稀释成10%的悬液，然后1000r/min离心10min。取上清，加入氨苄青霉素和链霉素，在37℃温箱中作用 1～2 h，-70℃下保存备用。

1.2.2.2 病毒增殖将处理好的病料接种于长满单层的IBRS-2细胞，盲传几代至出现明显细胞病变，收集病毒液-70℃冻存待用。IBRS-2细胞的培养方式根据常规传代培养方法进行。

（1）引物设计：参考刘邓等[4]发表的“Taq Man荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒”的方法设计上游引物 P1 为 5′-AACAAATCCAGGGCCACTT-3′，下游引物 P2 为 5′-TAAACTGGCGATCTGAGCA-3′。

（2）病毒核酸的提取：取300μL彻底融化的病毒液，加入500μL裂解液RL，室温静置2min，将gDNA Eraser Spin Column安放到2mL Collection Tube上，将裂解液转移到gDNA Eraser Spin Column中；12000r/min 离心 1min，弃 DNA Eraser Spin Column，保留2mL Tube中的滤液；然后加入等体积的70%乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀，立即全部转入RNA Spin Column中；12000r/min离心1min，弃滤液；加入500 μL Buffer RWA 至RNA Spin Column中，12000r/min离心30s，弃滤液；加入600μL Buffer RWB至RNA Spin Column中，12000r/min离心30s，弃滤液，然后重复此步骤；将RNA Spin Column重新安置于Collection Tube上，12 000 r/min离心2 min；再次将RNA Spin Column安置于1.5 mL RNase-Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入50μL RNase-Free ddH2O，室温静置5min；12 000r/min离心2min，洗脱RNA；采用紫外吸收法测定RNA纯度。

（3）反转录合成病毒cDNA：使用通用引物作为反转录引物，根据表1反转录系统和条件合成病毒cDNA。