基于有机酸高效液相色谱的葡萄酒品质分析

于 静 孙娅娜 孙翔宇,3 马婷婷,4 吴 颖 黄卫东

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院， 北京 100083； 2.北京市产品质量监督检验院， 北京 101300；3.西北农林科技大学葡萄酒学院， 陕西杨凌 712100； 4.西北农林科技大学食品科学与工程学院， 陕西杨凌 712100)

引言

葡萄酒中均含酸味物质，即有机酸。有机酸是一类含有羧基的化学物质，通常在葡萄果实生长过程中积累，经酿造过程转移至葡萄酒中，其对葡萄酒的味感、稳定性的形成和陈酿特性具有重要作用。葡萄与葡萄酒中的有机酸主要包括酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等。适量的有机酸是构成葡萄酒口感特征的要素[1-2]。有机酸的种类、浓度与葡萄酒的类型和品质有很大关系，调节着酸碱的平衡，影响葡萄酒的口感、色泽及生物稳定性。葡萄酒中每种酸各有特点和功效，在葡萄酒中发挥着不同的作用。除此之外，大量研究表明，有机酸具有抑菌、抗病毒、增加冠脉流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成等生理功能[1,3]。因此，有机酸的定量测定在葡萄酒品质鉴定中占有重要地位，已经越来越受到人们的关注[4-5]。

葡萄酒具有很强的自然属性，其品质与葡萄原料种植地区的生态环境、酿造工艺等有密切的关系，其中品种是葡萄酒品质最重要的决定因素之一，不同品种酿制的葡萄酒均具有其独特的品种风格[4-8]。在我国，单品种葡萄酒已经成为我国葡萄酒发展的重要特色。同时，年份也是葡萄酒品质最重要的决定因素之一，其主要原因在于葡萄酒生产年份的生态环境条件，尤其是气候条件难以人为控制[9]。国内外对于采用化学成分分析的方法鉴别葡萄酒已有较多的研究[5,10]，研究表明，不同品种、不同年份葡萄酒中许多物质含量有明显差异。

目前，对于葡萄酒中有机酸的检测有大量的报道，生物传感器技术[11]、Langmuir-Blodgget (LB)膜技术[12]、在线电渗析矩阵-液相技术[13]、傅里叶变换红外光谱[14]、近红外光谱[15]、电子舌[16]、毛细管电泳[17-19]、质谱[20]、液质联用技术[21]等均可应用于葡萄酒中有机酸的测定，然而，由于仪器普及率广，性价比较高，高效液相色谱技术仍然是使用最广泛的葡萄酒有机酸检测技术[1,4-5,8-9,22-26]。草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸是葡萄酒中含量最高，对葡萄酒品质贡献最大的7种有机酸[1, 4, 8-9]。因此，本文首先建立检测葡萄酒中该7种有机酸的HPLC方法。之后对品种葡萄酒、年份葡萄酒，以及市场葡萄酒(以北京市场为例)中的有机酸含量状况进行分析，以期为我国葡萄酒产业的发展提供参考，并为客观评价我国市售葡萄酒质量提供可靠的数据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器设备

年份葡萄酒样品：由北京市某酒庄提供，包含红葡萄酒(赤霞珠，Cabernet Sauvignon)2002、2003、2004、2005、2006、2007、2008、2009、2010、2011年共10个年份样品，以及白葡萄酒(霞多丽，Chardonnay)2003、2004、2005、2007、2008、2009、2011年共7个年份样品。所有原料均来自同一葡萄园，且酿造工艺均相近。

品种葡萄酒样品：5个单品种红葡萄酒，包含赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龙珠(Cabernet Gernischt)、黑比诺(Pinot Noir)、小味尔多(Petit Verdot)、马瑟兰(Marselan)，以及6个单品种白葡萄酒，包含霞多丽(Chardonnay)、贵人香(Italian Riesling)、白玉霓(Ugni Blanc)、维欧尼(Viognier)、雷司令(Riesling)、龙眼(Longyan)，均为中国农业大学葡萄酒科技发展中心于2013年酿造，原料均来自我国怀涿盆地某葡萄园，红、白葡萄酒各使用相近工艺酿造。

市场葡萄酒样品：购自北京某大型超市，样品包含5家北京本地生产商A(9个干红样品)、B(3个干红样品)、C(9个干红样品)、D(10个干红样品)、E(18个干红样品)； 4个国内其他产区：通化产区(5个干红样品)、沙城产区(4干红样品)、烟台产区(16干红样品)、天津产区(2干红样品)；以及进口红葡萄酒样品(21个干红样品)。对于白葡萄酒，随机采集了6种样品进行调查。此外，研究中采用苏格兰威士忌和中国劲酒2个非葡萄酒样品作为对照。

标准品：草酸(99.5%)(Oxalic acid)、酒石酸(99.5%)(Tartaric acid)、苹果酸(99.5%)(Malic acid)、乙酸(99.7%)(Acetic acid)、柠檬酸(99.5%)(Citric acid)、琥珀酸(99.5%)(Succinic acid)、乳酸(99.9%)(Lactic acid)，德国Dr. Ehrenstorfer 公司。甲醇(色谱纯)，迪马公司；磷酸二氢钾、磷酸(分析纯)，北京化学试剂公司。

仪器与设备：岛津LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)配二元高压泵、二极管阵列检测器、SIL-20A型自动进样器、柱温箱、色谱数据工作站，固相萃取仪，石墨化碳黑固相萃取柱。

1.2 方法

1.2.1色谱条件及标准品的配制

色谱柱：ST PAK C18-ES (5 μm，250 mm×4.6 mm, 120 A)；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH值至2.5；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：40℃；进样量：20 μL。

分别称取有机酸标准品100 mg左右至10 mL棕色容量瓶中，加入少量水震荡超声至完全溶解，用水定容至刻度摇匀，保证每种标准品质量浓度都在10 mg/mL左右，于4℃冰箱中储存。

1.2.2葡萄酒中有机酸定性及定量分析

称取葡萄酒样品10.00 g至100 mL容量瓶中，用水定容，涡旋振荡摇匀。分别用10 mL甲醇、10 mL水活化石墨化碳黑固相萃取小柱，将稀释好的葡萄酒样品过柱除去杂质，流速控制在1.0～1.5 mL/min范围，弃去前6 mL流出液，收集后段流出液，过0.2 μm针头过滤器(聚醚砜)，滤液用于高效液相色谱分析。

根据每种标准样品的单标保留时间来确定有机酸的出峰时间，并用200～500 nm波段扫描的特征谱图进行验证。采用峰面积外标法对有机酸进行定量。

2 结果与分析

2.1 有机酸高效液相色谱方法

首先，根据试凑实验法[27]获得最佳色谱条件，使待测7种有机酸达到良好的基线分离，所有色谱峰之间的分离度均大于1.5，能够达到完全分离，并且峰形尖锐，对称性好，可满足葡萄酒中7种有机酸的同时分离(图1)。同时，在该条件下，方法的线性关系与检出限、精密度与回收率如表1、2所示。

图1 7种有机酸标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of seven organic acid standards

表1 7种有机酸对照品标准曲线方程Tab.1 Retention time, regression equation and limit of detection of seven organic acids

表2 添加质量浓度、回收率与精密度Tab.2 Recoveries and relative standard deviationsof seven organic acids

由表可见方法回收率在95%～102%之间；相对标准偏差小于3%，满足试验对准确度和精密度的要求。

2.2 年份葡萄酒中有机酸特征分析

2.2.1年份红葡萄酒

本研究分析了年份对葡萄酒中有机酸含量的影响，所分析样品均为同一品种(红葡萄酒：赤霞珠；白葡萄酒：霞多丽)。年份红葡萄酒有机酸分布如图2所示。

图2 年份红葡萄酒有机酸分布Fig.2 Organic acid distribution diagrams of red vintage wines

首先，不同年份的红葡萄酒有机酸表现出了一定的年份特征，如2011年份葡萄酒中草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸含量均较低(图2a、2b、2e、2f)，不同年份的葡萄酒中，各有机酸组成与比例也略有不同(图2i)。其次，苹果酸与乳酸呈现出了良好的负相关性(图2c、2d)，如2011年份苹果酸含量最高，相应地，乳酸含量则最低；其他年份也类似，即苹果酸含量高，则乳酸含量低，反之亦然。原因在于葡萄酒中的乳酸主要来自于苹果酸-乳酸发酵过程[1-2, 4]，而该发酵过程是否进行取决于酒精发酵完成后葡萄酒中酸感的强弱。本研究中，2011年份葡萄酒，其苹果酸含量远高出其他年份葡萄酒，原因为该年份未进行苹果酸-乳酸发酵。2002—2011年，该酒庄的同一葡萄园生产的赤霞珠葡萄酒，其有机酸含量总和基本保持稳定(图2h)，略有波动；葡萄酒中主要的有机酸均为酒石酸与乳酸，并保持较高的比例，各有机酸比例略有波动(图2i)；表明有机酸是酒庄和葡萄园较为重要的固有特征之一，而不同年份的不同气相条件会造成一定的影响，导致其有机酸含量和组成的波动。

2.2.2年份白葡萄酒

年份白葡萄酒有机酸分布如图3所示。首先，不同年份的白葡萄酒有机酸也表现出了一定的年份特征，与红葡萄酒一样，2011年份葡萄酒中草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸含量均较低(图3a、3b、3e、3f、3g)。结合年份红葡萄酒数据(图2a)，2011年气候应与其他年份有明显不同。北京地区2011年出现近41年来最重秋冬连旱[28]，而在冷凉气候条件下，葡萄的酸度能够得到较好的积累，而高温干旱气候会导致葡萄中有机酸积累的减少[1]，这可能是2011年份的红、白葡萄酒中有机酸含量均有所降低的原因。这表明年份间气候的不同对于葡萄酒中有机酸含量和组成有一定的影响。苹果酸与乳酸呈现出了良好的负相关性，这与红葡萄酒中表现类似(图3c、3d)。此外，由图3c、3d还可以看出，2003年和2007年，该酒庄白葡萄酒进行了苹果酸-乳酸发酵，而2004、2005、2008、2009、2011年份未进行发酵。苹果酸酸感相对较高，而就红、白葡萄酒风格来讲，较高的酸度能够给白葡萄酒带来更好的口感[29]。这应该是该酒庄在多数年份未选择对白葡萄酒进行苹果酸-乳酸发酵的原因。2003—2011年，该酒庄同一葡萄园生产的霞多丽葡萄酒，其有机酸含量总和，以及各有机酸含量均发生了显著的变化(图3)，表明年份对于白葡萄酒的影响远大于红葡萄酒。

此外，其有机酸组成与红葡萄酒也明显不同，白葡萄酒中柠檬酸含量很高，苹果酸为主要的有机酸，其次为酒石酸(图3i)；而红葡萄酒中主要为酒石酸和乳酸，柠檬酸含量很低(图2i)。这与成冰等[30]的报道略有区别，原因可能在于取样酒庄酿造风格的不同。

图3 年份白葡萄酒有机酸分布Fig.3 Organic acid distribution diagrams of white vintage wines

2.3 品种葡萄酒中有机酸特征分析

2.3.1品种红葡萄酒

不同品种葡萄酿制的葡萄酒均具有其独特的品种风格[4-5,7-9]。本研究分析了品种对葡萄酒中有机酸含量的影响，品种红葡萄酒有机酸分布如图4所示。

图4 品种红葡萄酒有机酸分布Fig.4 Organic acid distribution diagrams of red variety wines

首先，不同品种红葡萄酒中，草酸(图4a)、酒石酸(图4b)、乳酸(图4d)、柠檬酸(图4f)含量显著不同，琥珀酸(图4g)与乙酸(图4e)品种间区别不大。其次，所测定样品中，除马瑟兰外，其余4个品种红葡萄酒均进行了彻底的苹果酸-乳酸发酵(图4c、4d)。在5个红葡萄品种上，酒石酸和乳酸均为最主要的有机酸，除赤霞珠、蛇龙珠为乳酸含量最高外，其余3个品种均为酒石酸含量最高。这与成冰等[30]报道的新疆产区的酿酒葡萄有机酸特征略有区别，原因可能在于产地一定程度上改变了葡萄的有机酸特征[6-8]。

2.3.2品种白葡萄酒

品种白葡萄酒有机酸分布如图5所示。

图5 品种白葡萄酒有机酸分布图Fig.5 Organic acid distribution diagrams of white variety wines

首先，不同品种白葡萄酒中，所测7种有机酸品种间均具有显著性差异(图5a～5g)，有机酸总量也差异很大(图5h)。其中，霞多丽具有最高的有机酸总量，其次为白玉霓、龙眼、维欧尼、雷司令、贵人香。在新疆产区[30]酿酒葡萄研究中，有机酸总量从大到小依次为霞多丽、白玉霓、雷司令、贵人香，与本研究完全相同，表明虽然产区(风土特征)会影响葡萄酒有机酸组成，但在不同产区，品种自身特性仍然能够得到表现[31]。其次，所测定样品中，除雷司令外，其余5个品种白葡萄酒均未进行苹果酸-乳酸发酵(图5c、5d)，这与白葡萄酒的风格有关[29]。在6个白葡萄品种上，除进行了苹果酸-乳酸发酵的雷司令主要有机酸为酒石酸和乳酸外，其余5个品种白葡萄酒主要有机酸均为苹果酸和酒石酸。这与成冰等[30]研究结果基本相同。

与年份葡萄酒结果(图2、3)对比可以发现，品种对葡萄酒中有机酸的影响远大于年份对葡萄酒中有机酸的影响。综合红、白品种葡萄酒数据可以发现，不同品种葡萄酒具有显著不同的有机酸特征，表明有机酸是葡萄酒重要的特征物质。但是本研究样本数量较少，无法定性定量表述各个葡萄酒品种的有机酸特征。未来研究中，可以通过大批量样品调研，分析确定各个品种葡萄酒的有机酸特征，从而能够应用单独或结合其他葡萄酒中特征物质用来鉴定葡萄酒品种、年份以及产地。TANG等[7]结合使用有机酸和多酚，成功鉴定了葡萄酒的品种以及葡萄酒的产地。

2.4 市场葡萄酒中有机酸特征分析

本研究对我国市场葡萄酒(北京市场为例)的有机酸含量状况进行了分析，结果如图6所示。

图6 北京市售葡萄酒有机酸分布Fig.6 Organic acid distribution diagrams of Beijing market wines

首先，葡萄酒中有机酸(图6a～6g)与其他酒类中有机酸有明显的特征区别(图6h)，苏格兰威士忌(图6h,样QT1)中检出6种有机酸(除柠檬酸外)，中国劲酒(图6h, 样QT2)中只检出了草酸，两类非葡萄酒中有机酸总量均显著低于葡萄酒，只有葡萄酒中有机酸总量的约1/10。其次，北京市场葡萄酒中有机酸品质状况整体较好。但是，检出了5款干红葡萄酒中柠檬酸含量超出国家标准[31]，分别为通化产区样品TH2和TH5(图6b)，以及烟台产区YT8、YT9、YT13(图6d)，超标检出率为4.9%。其中，TH2和TH5柠檬酸质量浓度分别为4.09 mg/mL和5.06 mg/mL，是国家标准(1 mg/mL)4～5倍，柠檬酸占总有机酸百分比分别为75%和87%，经北京市产品质量监督检验所后续抽检确定，该两款产品均为勾兑生产的假酒，其生产商为通化当地某两家小型企业。此外，烟台产区YT8、YT9、YT13柠檬酸质量浓度分别为1.47、1.57、1.49 mg/mL，超出国家标准，同时柠檬酸所占百分比(分别为34%、27%和39%)显著高于其他葡萄酒样品，查阅样品信息，发现该3个样品均来自烟台产区某企业，而且该3个样品均为异地酒灌装生产，虽未经质检部门后续检验确定，但也极有可能为勾兑灌装的假酒。这表明使用柠檬酸总量及柠檬酸占有机酸总量比值，可以初步地检测勾兑假酒，尤其是“三精一水”勾兑的低劣等葡萄酒。

红、白葡萄酒样品有机酸区别明显，所测92款红葡萄酒(剔除5款问题样品后)中主要有机酸均为酒石酸和乳酸，同时柠檬酸含量较低(图6a～6f)；而所测6款白葡萄酒中，主要有机酸均为苹果酸和酒石酸，同时具有较高的柠檬酸含量(图6g)。这与红、白葡萄酒风格不同有关[29]。

同时，所测92款红葡萄酒样品，不同样品有机酸分布范围以及各有机酸所占比例值分布广泛，原因可能是因为所取样品来自不同产区、不同品种。与此同时，这些样品所使用的酿造工艺、所使用酿酒酵母、陈酿时间等均具有较大差别，而这些因素均会不同程度上影响葡萄酒中有机酸的组成[1,4-5,7,9,32-38]。

比较国产红葡萄酒(图6a～6e)与进口红葡萄酒(图6f)，进口红葡萄酒中酒石酸所占有机酸总量比值显著高于国产红葡萄酒中该值，而乳酸所占有机酸总量比值显著低于国产红葡萄酒中该值。所测进口葡萄酒基本均来源于欧洲，气候条件与我国不同，同时产品类型多为陈酿型葡萄酒有关[9,29,33,39]。比较所测5个国内产区(北京、通化、沙城、烟台、天津)(图6a～6e)，不同产区也有不同的特点，如通化产区琥珀酸含量均较低(图6b)，北京产区乳酸所占有机酸总量比值(图6a)显著高于其他产区等。这表明产区会显著影响葡萄酒中有机酸含量。比较北京产区5家不同生产商(图6a)，也能够发现一定的区别，如生产商A，其苹果酸含量以及占有机酸总量比值均显著高于其他4家生产商。这表明不同酒庄的不同酿造风格也会显著影响葡萄酒中有机酸含量。

3 结论

(1)建立了葡萄酒中7种常见有机酸的HPLC检测方法，在最优色谱条件下7种有机酸均得到了很好的分离，经方法学验证，各有机酸的线性关系良好，检测限低，加样回收率准确度较高，相对标准偏差较好。使用该方法对年份葡萄酒和品种葡萄酒进行了分析，发现年份和品种均对红、白葡萄酒中有机酸有一定的影响，其中品种的影响较大，年份的影响则较小，年份对于白葡萄酒的影响远大于红葡萄酒。

(2)红、白葡萄酒有机酸组成也明显不同，红葡萄酒中主要为酒石酸和乳酸，柠檬酸含量很低；而白葡萄酒中柠檬酸含量很高。综合红、白品种葡萄酒数据可以发现，不同品种葡萄酒具有显著不同的有机酸特征，表明有机酸是葡萄酒重要的特征物质。但是本研究样本数量过少，无法定性定量表述各个葡萄酒品种的有机酸特征。

(3)使用该方法对北京市售葡萄酒有机酸含量状况进行了分析。所测103款葡萄酒样品中，柠檬酸超标仅有5例，超标检出率为4.9%，表明北京市场葡萄酒中有机酸品质状况整体较好。使用有机酸可以有效区分葡萄酒与非葡萄酒；使用柠檬酸总量以及柠檬酸与有机酸总量比例值，可以初步检测勾兑假酒，尤其是“三精一水”勾兑的低劣等葡萄酒。此外，进口葡萄酒与国产葡萄酒、不同产区葡萄酒、不同酒庄葡萄酒有机酸特征均不相同。

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