耐旱马铃薯品种青薯9号不同时期叶片差异蛋白分析

张凤军， 叶景秀， 王燕钧， 王 舰

（1.青海省农林科学院， 西宁810016； 2.青海省马铃薯育种重点实验室， 西宁810016；3.青海省高原生物技术教育部重点实验室， 西宁810016）

干旱是强烈限制作物产量的三大非生物因素之一，造成的损失最大，是其它逆境造成损失的总和［1］。世界上约36%的土地分布在干旱地区，占总耕地面积的42.9%，其余可耕地在作物生长季节也经常发生季节性干旱［1］。在我国尤其是干旱和半干旱地区，缺水问题一直是限制农业生产的最主要因子，即使是降水较多的地区也普遍存在季节性和非周期性干旱问题［2］。

马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物，全球范围内普遍栽培。马铃薯是典型的温带气候作物，对土壤干旱比较敏感。干旱严重影响着马铃薯的生产。因此，如何挖掘干旱、半干旱地区马铃薯生产潜力，了解马铃薯抗旱机理及遗传特性，培育抗旱品种成为马铃薯育种工作者目前急需解决的问题［3］。

国内外对马铃薯抗旱机理的研究已在形态学和生理学及基因表达变化等方面进行了大量研究［4－6］。近年来，基于固相化pH 梯度（IPG，immobilized pH gradients）双向凝胶电泳（2－DE，2－dimemional gel electrophoresis）的蛋白质分离技术及电喷雾质谱（ESIMS，electrospray ionization mass spectrometry）、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI－TOFMS，matrix assisted laser desorption ionization timeof－flight mass spectrometry）等鉴定技术在蛋白质分析中的应用，以及蛋白质组信息学的兴起，促进了蛋白质组研究的发展。李伟等［7］对耐旱品种在干旱胁迫下马铃薯茎段蛋白的双向电泳图谱进行了分析，分析了127个差异表达的蛋白点，其中108个表达量显著上调，12个显著下调，得到7个新增蛋白。章玉婷等［8］对云南地方耐旱品种在苗期进行了相关的蛋白质组学研究，该研究仅在马铃薯生长的一个时期进行了相关的研究，获得了12个表达差异蛋白点，并进行了功能分类。

研究耐干旱胁迫马铃薯种质在干旱胁迫时蛋白质的变化，将有助于认识干旱环境胁迫对蛋白质合成的影响、特异蛋白质的功能及其与抗旱性的关系，从而为深入研究干旱胁迫下的基因表达变化及相关基因克隆奠定基础。本试验利用蛋白质组学方法与技术，比较耐旱马铃薯品种青薯9号在不同生育时期叶片蛋白质组的差异，寻找和马铃薯耐旱紧密相关的差异蛋白，通过 MALDI／TOF／TOF－MS／MS 质谱方法鉴定与分析，以期阐明其生物学功能，为耐旱马铃薯品种的培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为青薯9号，由青海省农林科学院生物技术研究所选育，该品种抗旱性强，适应性广，尤其在西部干旱、半干旱地区种植效益比较显著［9］。

1.2 方 法

种薯选用青薯9号原种，大田种植，生育期不浇水，管理同大田生产。分别在苗期、盛花期和盛花后期09：00时取3株顶叶下完全展开叶第4片复叶，去掉叶柄，混合各裂叶放入封口袋，置于－80℃冰箱中保存备用［10］。

1.3 马铃薯叶片蛋白质的提取

参照叶景秀等［11］和章玉婷等［8］的 TCA／丙酮法提取总蛋白质。采用Bradford法［12］测定蛋白质浓度。

1.4 双向电泳

第一向IEF－PAGE（IEF，Isoelectric Focusing，等电聚焦），在 Bio－Rad PROTEAN IEF Cell等电聚焦仪上完成；第二向SDS－PAGE，在Bio－Rad PROTEANⅡxi Cell电泳仪上进行。用考马斯亮蓝显示蛋白点分布，台湾力捷公司的 UMAX Power Look 2100 XL光密度扫描仪扫描获取图像，在获得较好重复性的基础上，用蛋白双向电泳分析软件（Bio－Rad PDQuest 8.0.1）分析双向电泳结果，找出差异蛋白质点。

1.5 质谱鉴定及数据库检索

将差异表达的目标蛋白质点切下，经脱水、还原、烷基化、酶解和脱盐等处理；用 MALDI－TOF－MS质谱 仪 （Voyager－DESTR MALDI－TOF－MS；Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）测得肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting，PMF），将 PMF数据输入Mascot、Peptldent等数据库，对其序列进行同源性比对。蛋白质功能分析在Pfam等蛋白质功能数据库中进行，鉴定耐旱的特异蛋白。

2 结果与分析

2.1 不同发育时期的蛋白质双向电泳分析

采用pH 4－7的非线性IPG干胶条和12%SDSPAGE胶对青薯9号3个不同发育时期的叶片蛋白进行IEF－SDS－PAGE分离，经考马斯亮蓝染色后，获得了分辨率和重复性较好的2－DE图谱。采用双向电泳分析软件（Bio－Rad PDQuest 8.0.1）对 3 个 时 期 的2－DE图谱进行分析。比较苗期和盛花期的蛋白质组2－D图谱，在苗期图谱上找到表达量高于初花期1.5倍以上的蛋白质点共6个（蛋白编号：109，110，111，113，353，362）（图1），在盛花期图谱上找到表达量高于苗期1.5倍以上的蛋白质点共10个（蛋白编号：141，143，148，150，153，154，157，158，195，196）（图2），其中有1个点在苗期没有，为新增蛋白点（蛋白编号：150）；比较盛花期和盛花后期的蛋白质组2－D图谱，在盛花期图谱上找到表达量高于盛花后期1.5倍以上的蛋白质点共11个（蛋白编号：143，144，150，151，152，154，155，156，158，159，160）（图2），在盛花后期图谱上找到表达量高于盛花期1.5倍以上的蛋白质点共4个（蛋白编号：192，193，200，366）（图3）。

2.2 差异蛋白的 MALDI／TOF／TOF－MS／MS分析和数据库检索

将27个差异表达的蛋白质点从双向电泳胶上切下，进行消化、酶解，酶解后的混合物经MALDI－TOFTOF－MS分析和数据库检索鉴定，共鉴定得到26个差异蛋白（表1）。功能分类表明，这26个蛋白可能分别参与光合作用、能量代谢、细胞生长和分化、调控、抗性等生理生化过程，其中有1个蛋白为未知蛋白。

3 讨 论

马铃薯是典型的温带作物，对水分亏缺较为敏感，干旱是限制马铃薯生长和生产的主要限制因素［13］。在不同生育时期，马铃薯对水分的需求不同，现蕾期至盛花期是需水量最多的时期，若该时期水分供应不足，将影响马铃薯的植株发育、产量和品质［14－15］。因此，寻找抗旱性强的马铃薯生长过程中其差异表达的蛋白质对了解其抗旱性有重要的意义。

图1 青薯9号苗期2－DE图谱

图2 青薯9号盛花期2－DE图谱

表1 蛋白质质谱鉴定检索结果

图3 青薯9号盛花后期2－DE图谱

本研究中，在现蕾期鉴定到的6个差异蛋白的表达量与盛花期相比较高，超过盛花期的1.5倍，与光合作用、抗氧化和能量代谢有关，这6个蛋白为：ATP合成酶β亚基、核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基（蛋白点110和111鉴定为同一蛋白）、2－半胱氨酸氧化还原酶、半胱氨酸合成酶、烯醇化酶，说明马铃薯植株在现蕾期就建立起了强大的光合作用和抗氧化系统，为植株的抗旱作用奠定基础。ATP合成酶是能量代谢的关键酶，通过氧化与光合磷酸化反应合成ATP进行能量转换［16］。ATP合成酶上的β亚基是光合磷酸化的催化中心，是合成ATP的关键所在。ATP合成酶β亚基的增量表达，能够抵御逆境的危害［17］。核酮糖－1，5－二 磷 酸 羧 化 酶／加 氧 酶 （ribulose－1，5－bisphosphate carboxylase／oxygenase，Rubisco）是植物光合作用过程中固定CO2的关键酶，对光合作用的效率起 关 键 作 用［18］。2－半 胱 氨 酸 氧 化 还 原 酶 （2－Cys peroxiredoxin，2－CP）是普遍存在于植物体内的一种抗氧化物酶，是植物清除活性氧的关键酶之一。2－CP的作用机制是将2个高度保守的半胱氨酸通过内部或分子间二硫键的再生，使得2－半胱氨酸氧化还原酶具有催化活性，将H2O2分解，进而不能产生活性氧［19］。相关研究表明，增强植物抗逆性的途径之一是提高植物体内抗氧化酶类代谢的水平［20］。因此，马铃薯2－CP基因的增强其表达，对马铃薯抗逆性的提高有积极的意义［19］。

盛花期是马铃薯块茎形成的关键时期，这一时期是马铃薯叶片的各项生理指标处于非常活跃的时期。这一时期的差异蛋白，主要与光合作用，能量物质代谢、蛋白质合成、细胞生长分化、抗逆等有关。与光合作用相关的蛋白质有：叶绿体核糖－5－磷酸异构酶、碳酸酐酶；与能量物质代谢相关的蛋白质有：NADP－苹果酸酶、硫胺素噻唑合成酶、叶绿体锰稳定蛋白等；与抗逆相关的蛋白质有：NAC转录因子、乳酸谷胱甘肽裂解酶、吡哆醛生物合成蛋白、富含甘氨酸RNA结合蛋白等。盛花后期主要鉴定出4个差异蛋白，主要与光合作用和抗逆有关。铁氧还蛋白－NADP还原酶是叶绿体中参与电子传递的蛋白，是一个与类囊体膜疏松结合的可溶性铁硫蛋白，能进行电子氧化还原反应，是PhotosystemⅠ的重要组成部分［21］。谷氧还蛋白在制植物的抗逆信号转导中具有重要作用，具有抗氧化、干旱以及盐碱的作用［22］。由此可见，马铃薯在盛花期和盛花后期差异蛋白的高表达，对马铃薯植株稳定的光合作用和提高自身的活性氧清除能力抗氧化作用起到很好的作用，利于马铃薯的高产、稳产和对干旱胁迫的适应能力。

综上所述，本研究鉴定出的26个差异蛋白质分别参与了物质、能量代谢、光合作用、抗氧化作用等生理过程。分析表明，这些蛋白的差异表达可能与马铃薯品种青薯9号较强的抗旱性有关。本研究结果初步从蛋白质水平解释了马铃薯品种青薯9号抗旱的原因，对耐旱马铃薯品种的培育提供了一定的理论依据。

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