中国烟草种质资源创新研究进展
2018-01-17王国平周东洁牛永志常爱霞肖江海郑昀晔
王国平， 周东洁， 牛永志， 常爱霞， 肖江海， 郑昀晔，2
（1.玉溪中烟种子有限责任公司， 云南 玉溪653100； 2.云南省烟草农业科学研究院， 云南 玉溪653100；3.中国农业科学院烟草研究所， 山东 青岛266100）
烟草种质资源能够为新品种选育和分子标记、基因挖掘等基础研究提供原材料，是育种的基础，关乎到烟草事业的持续稳定发展。种质创新是丰富种质资源的重要途径，我国在种质创新方面取得了较大的成就。烟草种质资源库搜集保存的种质有5 267份（截止到2011年12月），是世界上保存数量最多的国家［1］，构成丰富的遗传背景。本文从杂交、诱变、细胞工程、转基因以及分子标记5个方面对我国烟草种质创新成果进行阐述，并进一步作出展望，为今后的育种和种质创新工作提供参考。
1 杂 交
杂交是种质创新的最基本手段，对亲本进行有性杂交或回交，通过系谱选择、混合选择等方式，培育出优质、抗病、高产的优良新品种，其仍然是目前和今后相当长时间内新材料创制的主要方式。按照亲本的亲缘关系，杂交又可分为种内杂交、科属间杂交和远缘杂交，种内杂交不存在远缘杂交不亲和性，故为主要应用方式。
1.1 种内杂交
我国常规育种研究起始较早，但初有成效追溯到20世纪60年代［2，3］，总体上可以分为2个阶段：80年代以前和80年代以后。80年代以前我国育成的品种主要有金星6007、净叶黄、小黄金1025、DB 101、特字401、402以及革新系列、晋太系列、辽烟系列，春雷一号、二号，翠碧一号、永定一号、单育二号等。这些烟草品种三大主要亲本为滕县金星、特字400和大金元，其他品种基本都是以特字400及衍生材料特字401、特字402，滕县金星的衍生材料金星6007为亲本选育而成，其次以大黄金、小黄金以及部分地方品种厚节巴、烟变子、乔庄多叶等为亲本材料选育而成［4］。80年代以后，从国外引进了优质烤烟 K 326、G 28、NC 82和NC 89等，我国主要依赖于这些亲本杂交选育出众多品种，同时创制了大批高世代品系，目前通过审定的有150余份，主要有中烟、云烟、湘烟、秦烟、辽烟、安烟、豫烟、闽烟、鄂烟、龙江系列等［5，6］。经过几代人的不懈努力，我国的种质资源数量不断被刷新，为我国烟草事业的发展做出了重要贡献。
1.2 远缘杂交
远缘杂交可以打破种属间的界限，扩大遗传变异，产生特异的杂种优势，因而是种质创新的一条重要途径。但远缘杂交的最大障碍就是不亲和性，不同的烟草品种间杂交和不同的杂交方式（正反交），其结实率和单果结籽数都存在显著差异［7］。野生烟N.stocktonii和N.nesophila分别与小黄金1025、大黄金5210和大白筋599正交有较高的结实率，反交却基本上不孕，在杂交花朵的花柄基部涂以20～100mg／L浓度的2，4－D、NAA 均可有效地提高杂交结实率［8］；云烟87与N.plumbaginifolia正交后代雄性败育，但雌性可育，后代大部分外观形态指数介于双亲之间，且具较强的黑胫病抗性，反交却不结实［9］。此外，也存在研究报道不一致的现象。廖菊够等［10］将 K 326分别与N.rustica和N.debneyi正反交，结果正交不结实，反交可以获得种子，但萌发率较低；朱楠等研究表明，MSK 326 与 N.debneyi、N.rustica、N.alata 正 交 不亲和 ，N .debneyi、N .rustic、N .stocktonii、N .repanda与 K 326反交，只有 N.debneyi 获得萌发的种子［11］；姚恒等研究表明，N.rustica、N.repanda 和 N.stocktonnii与K 326、红大、云烟87、云烟97杂交不亲和，N.alata作为母本与栽培烟草杂交不亲和，作为父本可以结实，但种子不萌发［12］。
1.3 科属间杂交
不同科属间的远缘杂交可以创造出特异的种质资源。我国先后利用普通烟草龙烟2号与曼陀罗进行属间远缘杂交，培育出含阿托品及莨菪烷生物碱的新型烟草，并通过无性与有性杂交相结合的方法克服不孕，获得稳定后代［13，14］。以同样的方式，普通烟草78－04与药用植物白花曼陀罗杂交育出的新型烟草品系长柄曼陀罗烟具有低糖、中高烟碱，含有东莨菪碱和阿托品等药用成分的特点［15］。
2 细胞工程
细胞工程是克服远缘杂交不亲和的重要手段。在20世纪90年代，我国实现了NC 89和宁夏枸杞［16］、普通烟草与野生烟［17］、柳叶烟和大圆叶菠菜［18］等的不同科属种之间的细胞融合。同时也筛选出大批优良材料，夏镇澳等［19］，宛新杉等［20］诱导融合普通烟草革新一号和龙葵的原生质体，得到了细胞杂种，又经5代选择与培育，选出了新品系694－L。黄文川［21］鉴定了烟草种间体细胞杂交高代材料Z 14的性状，其主要农艺性状表现优良，高抗CMV和TMV；中国农业科学院烟草研究所［22，23］将革新一号与黑老虎原生质体培养成株后，用大白筋599和NC 82进行多年回交改良，选育出了品质优良，兼抗多种病害的TR新品系以及88－4等具有特殊香味的衍生烤烟新品系；同时又将普通烟与N.glauca细胞融合得到一个胞质杂种TG－8，用G 28与之连续回交4代后，得到新胞质雄性不育系86－6以及衍生杂交种92－7和92－8。此外，我国利用花药离体培养的方式也培育出了单育一号、单育二号、单育三号、NC 89和皖烟一号以及烤烟特香型品种3002和3041。
3 诱 变
诱变能够随机突变基因组信息，从而改变植株的遗传特性。其具有突变效率高、见效快等优点，是种质创新的又一重要手段。按照诱变方式可以分为物理、化学、航天及其他诱变。
3.1 物理诱变
从上世纪80年代到目前为止，我国曾有很多学者探索过60Co－γ射线辐射以及离子注入对烟草植株生长发育、品质、抗氧化酶活性、生理特性、钾含量以及种子活力、发芽率等的影响，诱变后大都对烟草植株或种子不利。但也筛选出一些优异的材料，殷凤生等［24］利用氮离子注入处理G 80干种子，经连续选择鉴定，选育出一个性状稳定、优质抗病的新品系。王万军等［25］利用60Co－γ射线辐射8611、K 326、NC 89花蕾，分别在NC 89、8611突变体中筛选到抗CMV植株各2株、1株，并结合花药离体培养的方式获得了抗CMV种质。
3.2 化学诱变
化学诱变利用率比较高的试剂是甲基磺酸乙酯（EMS），中国农业科学院烟草研究所自2008年主持国家局烟草突变体创制项目以来，已经从中烟100 EMS诱变4、5代材料中筛选出部分抗病性、抗逆性、耐低钾、高香气等不同类型的具有育种价值的材料，并正在进一步鉴定利用［26］。其他的化学诱变剂有致病病原菌［27－29］及其毒素［30，31］、氨基酸及其类似物［32］、抗菌素［33］等，将他们作为选择压诱导愈伤组织、花药或细胞悬浮液产生突变体。
3.3 航天诱变
航天诱变具有变异频率高、幅度大，可以达到地球上无法实现的诱变效果等优点。经过航天诱变后烟株的生物学性状和农艺性状均会发生不同程度的正负向变异［34，35］；种子诱变后的发芽率和发芽势均低于对照［36］，而且随贮藏时间增加，下降的趋势高于对照［37］；烟株诱变后的SOD、POD、CAT和ASA活性都显著或极显著高于对照［36］。2002年，贵州省烟草科学研究所利用神舟3号搭载了13个烤烟品种，并从K 326、春雷3号、GT 11和 K 346等推广品种中鉴定获得了一批多腋芽矮化［38］、高抗坏血酸［39］和皱叶晚育［40］等变异材料。2005年，云南烟草研究院和河南省农科院烟草研究所通过神州6号飞船搭载了一些烟草种子。2004年和2006年中国农业科学院烟草研究所分别搭载9份和10份材料，并鉴定筛选到诱变红大、翠碧一号、G 80、NC 89等5、6 代的抗病材料，目前在进一步观察。
3.4 其他突变
其他类型的突变主要包括无性系变异［41］和T－DNA激活标签插入突变。中国农业科学院烟草研究所主持的国家局烟草突变体创制项目，利用T－DNA激活标签插入的方式创制突变体，筛选到了抗病、多腋芽、叶皱、白茎、不育、矮化等众多新材料，并对部分性状进行了遗传分析和基因定位克隆。
4 基因工程
转基因技术不仅是一种基础研究的手段，在定向改良品种性状方面，更具有见效快、目标明确、效率高等优点。但转基因材料的应用还存在诸多问题，目前主要作为一种战略性的热点研究工具。我国在利用转基因技术提高烟草抗虫性、抗病性、抗逆性、品质等方面做了大量的研究。
4.1 转抗病基因
培育抗病转基因烟草的第一种途径为：将来源于病菌或植物中的抗病基因或抗病生理调节关键基因导入到烟草中来提高其抗病性。例如：将大豆细菌性斑点病菌Psg 12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草云烟87，获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的植株［42］；将菜豆几丁质酶基因Bchi转入烟草显著提高了其对真菌病害的抗性［43］；将小麦TaPIM1基因转入烟草，显著提高了其对青枯病的抗性［44］。第二种途径为：针对烟草病毒病，通过转病毒外壳蛋白基因（CP）、运动蛋白基因（MP）、复制酶基因（Rep）的方式或者病毒RNA介导的方式等获得抗病毒病转基因材料。例如：将PVX和PVY的病毒CP基因转入NC 89，获得了抗两种病的材料［45］；通过RNA介导的病毒CP基因，获得了稳定的多抗TMV、CMV和PVY转基因 NC 89［46］；应用 RNAi技术沉默掉 TMV CP 基因，获得 TMV 免疫的材料 K 326和龙江911［47］；应用RNAi技术沉默TMV MP基因和CMVRep基因，获得同时抗TMV和CMV的转基因 K 326［48］。
4.2 转抗虫基因
目前报道的抗虫基因主要有Bt内毒素基因、植物凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因等。练云等［49］将人工改造的Bt基因cry1Ac和cry1Ie分别单独和同时导入到烟草中，发现2种Bt基因在烟草中能协同作用，提高了烟草对野生型棉铃虫和Cry 1Ac棉铃虫的抗性；转蜡梅凝集素基因烟草具有明显的抗蚜虫和抗蛞蝓活性［50］；转半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因CaCPI的烟草，在接虫5d后植株上的蚜虫累积死亡率约90.75%［51］；转 苏 云 金 芽 胞 杆 菌 中 的 抗 虫 基 因cry2Ab4和vip3Aa11烟草，显著提高其对小地老虎的抗性［52］。
4.3 转抗逆基因
抗逆主要分抗寒、抗旱、耐盐和耐重金属等。抗逆基因来源主要是渗透调节相关基因（脯氨酸、果聚糖等）、抗氧化防御体系相关基因（SOD、CAT、APX基因等）、调控蛋白相关基因（转录因子、信号转导基因等）和膜结构蛋白相关基因等。果聚糖合成酶基因6－SFT的转基因烟草W 38对干旱和寒冷胁迫具有较强抗性［53］；转胡杨木葡聚糖内转糖苷酶／水解酶基因PeXTH，能够提高烟草抗旱性［54］；转抗氧化酶基因2－Cys Prx能够有效减轻烟草对盐和高光胁迫引起的PSII光抑制［55］；过量表达脯氨酸能够增强烟草细胞对毒性重金属镉的抗性［56］；过量表达荷花液泡膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因NnNHX1能够提高转基因烟草的耐盐性［57］。
4.4 转品质相关基因
目前烟草品质基因研究较多的有钾含量、光合作用、氮代谢和次生代谢等相关基因。谭颖等［58］将钾转运体蛋白基因HAK1和烟草TMV抗性蛋白基因CN的pSH－TH共同转入烟草，并筛选无选择标记的植株，获得的安全转基因株系可作为高钾亲本材料供育种利用；阳春砂1－去氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶基因DXR超表达转基因烟草的DXR活性及光合色素含量均得到提高［59］；苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因转基因烟草的生物产量和氮利用效率均得到提高［60］；拟南芥AtPAP1的转基因烟草中花青素含量明显提高［61］；沉默烟草中编码谷胱甘肽转移酶基因NtAN9，导致花青素苷的积累受阻，含量大幅降低，花色由粉红变为白色［62］。
4.5 转早花基因
常爱霞等［63］利用转拟南芥早花基因FT的材料，结合TMV抗性基因N分子标记筛选的方式，快速回交改良中烟100的TMV抗性，一年多时间就能回交加代到BC4F1，比常规回交育种时间缩短450～500d，并最终筛选获得了不含有转基因元件，不含FT基因的材料。该方法为烟草种质资源创新开辟了一条捷径。
5 分子标记技术
分子标记技术是数量性状基因研究的主要手段，目前烟草中应用最为广泛的分子标记主要是SSR与SNP。我国在烟草抗病、产量、品质等关键基因定位和关联分析方面取得了重要进展，同时，也利用分子标记辅助育种的方式成功培育出抗黑胫病的红花大金元以及抗病毒病的K 326。
5.1 抗病相关标记
文轲等［64］以CMV抗病品种台烟8号、感病品种NC 82为亲本，构建288株BC1分离群体，并用筛选得到的6 2对多态性引物定位到1 0号连锁群上的SSR标记53735与抗病QTL紧密连锁，遗传距离为0.1cM，贡 献 率 为 13%。 徐 石 剑 等［65］以 TI 245 为TMV抗病亲本、K 326为感病亲本，构建160株F2群体，并利用166对SSR多态引物定位到QTL位点与标记 TP 217200，遗传距离为3.3cM，并发现 TI 245是由一对隐性基因控制，与前人研究结果由两对隐性基因控制不一致。高玉龙等［66，67］以N 基因主导TMV抗性的Coker 176为抗病亲本，以K 326为感病亲本，定位到N 2标记与QTL遗传距离为4.3cM，并验证N 2标记可用于N基因控制TMV抗性的分子标记辅助选择育种。王贵等［68］利用抗PVY品种RY 5和感病品种Coker 176构建F2群体，筛选到Va基因主导的PVY抗性紧密连锁的分子标记O 12V3695，遗传距离为2.1cM。刘勇等［69］利用番茄和辣椒中eIF 4E家族基因保守序列，设计特异标记，定位到标记CF 2GR 11与烟草PVY抗病基因Va的遗传距离为0.99cM。蒋彩虹等［70］以抗赤星病品种净叶黄和感病品种NC 82为亲本，定位到一个紧密连锁的SSR标记，遗传距离为4cM。Tong et al［71］以抗赤星病品种净叶黄与感病品种长脖黄构建F2群体，利用SSR标记共定位到3个QTLs，抗性增效基因均来自抗源净叶黄。高亭亭等［72］利用抗黑胫病品种 Beinhart 1000－1和感病品种小黄金1025构建了220个F2分离群体，定位到5个与烟草黑胫病抗性紧密相关的 QTLs。Xiao et al［73］利用黑胫病抗源Florida 301和Hicks构建重组自交系，定位到11个QTLs，其中位于7号连锁群上的主效QTL与来源于抗源Beinhart 1000－1的主效位点位置一致。童治军等［74，75］定位到Ph基因控制黑胫病抗性的紧密连锁标记 TM 29、TM 50、Scf 30K、TM 62、ST 141和InDel 0617可用于分子标记辅助育种。牟建英等［76］以抗白粉病品种台烟7号，感病品种NC 89为亲本，构建285个单株的F2群体，定位到SSR标记52725与QTL紧密连锁，遗传距离为1.01cM。杨柳等［77］利用青枯病抗源岩烟97与红花大金元组合的F2∶3家系，在烟草17号连锁群上定位到2个主效QTLs和4个具有上位性的微效 QTLs。Qian et al［78］利用Enshu×TI 448A以及岩烟97×TI 448A 两个组合构建了F2∶3和F2∶4群体，并在不同环境条件下定位到4个青枯病QTLs，且在两个群体中，都可以重复定位到连锁的两个标记PT 20275和PT 30229。杨友才等［79］利用高感青枯病品种红花大金元与高抗品种TI 448A，证实了RAPD标记S 503与烟草青枯病抗性基因连锁，遗传距离6.261cM。高加明等［80］对kokubu和胶南香料烟杂交组合进行了分析，筛选出一个源于kokubu的抗青枯病标记2303，遗传距离8.73 cM。吴超等［81］以78份烟草种质为自然群体，关联分析得到6个MFLP标记与烟草青枯病抗性显著相关。详细信息见表1。
5.2 品质与产量性状相关标记
肖炳光等［82］以 G 28和 NC 2326为亲本材料，构建了137个株系的烤烟DH群体，利用4个环境下的试验数据，进行了总糖、烟碱和氧化钾3种烟叶化学成分的QTL初步分析，共检测到7个加性效应QTLs和9对加加上位性效应QTLs。李华丽等［83］以烤烟台烟7号与白肋烟白肋21为杂交亲本，构建了127个F2和F2∶3家系群体，对烟叶烟碱、总氯、总钾、叶长、茎叶夹角等重要性状进行QTL定位，检测到2个烟碱相关QTLs、2个总氯相关QTLs、1个总钾相关QTL、4个叶长相关QTLs和1个茎叶夹角相关QTL。童治军等［84］以红花大金元和Hicks杂交构建了207个DH家系，共检测到与烟叶株高、茎围、节距、叶片数、最大腰叶长和最大腰叶宽6个重要性状相关的69个QTLs。谭效磊等［85］利用易烤性好的烤烟品种云烟85和易烤性差的烤烟品种大白筋599杂交所得到的F2群体，共检测到与易烤性相关的4个QTLs。余义文等［86］利用24份烟草种质，对亚硝胺含量进行关联分析，发现1个SSR位点和6个MFLP位点至少与1种TSNA含量极显著关联。张吉顺等［87］以258份国内外烤烟品种为自然群体，在2个环境下调查了13个农艺性状，共检测到18个SRAP标记与6个农艺性状显著关联。王国平等［88］对不同生态区60份烤烟种质的76种致香物质含量进行了关联分析，共检测到5个SSR标记与6个致香物质同时在2个生态区极显著关联。
表1 抗病QTL定位及连锁标记信息
6 展 望
6.1 加强种质资源收集、引进与鉴定
种质本身特征特性是种质资源创新的根本，决定着种质创新的成功与失败。我国现有保存的种质资源数量位居世界第一，但在遗传多样性、特色、稀有种质方面还存在不足。因此，需要加大对种质资源的收集、引进和鉴定。
1）对全国范围内各个地方考察调研或联合各地方烟草单位收集汇总，发掘未知种质。
2）加强国外种质资源的引进，目前国外引进种质数量只占我国总保存数的15.17%，但在利用次数最多的27份种质中，国外资源的利用率却达到66.52%［5］，可见国外的资源具有很多我国不具备的优异基因，对我国烟草发展起着重要作用。此外，我国不是烟草的发源地，野生资源相对较少，而野生种在长期的自然进化中，蕴藏着许多抗病、抗虫、抗逆、优质等稀有基因，加强对野生资源的引进利用对于创新突破性种质尤为重要。
3）在种质资源鉴定方面，美国对保存的烤烟和野生资源进行了比较系统的抗病、抗逆、农艺、品质等鉴定，大大提高了育种亲本选择的针对性和预见性。我国虽然取得了一些成效［89，90］，但还存在不系统、不完整、不深入的情况，导致可利用种质数量有限，品种遗传背景日趋狭窄，种质鉴定工作仍需进一步加强，特别是在满足我国烟草农业和中式卷烟需求的抗病、高香气、特色香型等性状方面。
6.2 加强种质资源创新理论研究
创新突破性种质还需要基础研究的支撑，特别是在远缘杂交、细胞工程、转基因和分子标记技术方面。国外很早就利用细胞工程和远缘杂交的方式将一些抗病基因导入了栽培烟草中，现有部分烟草品种的黑胫病抗性基因来源于野生烟N.Plumbaginifolia和N.longiflora，并由N.Plumbaginifolia先后育成抗黑胫病品种 NC 2326、NC 567，由 N.longiflora 育成McNair 30、NC 60、K 394等；TMV 抗性基因来源于N.glutinosa，先后育成 Va 770、Coker 86等；根黑腐病抗性基因来源于N.debneyi，先后育成MD 10等系列品种。在分子育种方面，国外对黑胫病抗性基因Ph［91］、TMV 抗性 基 因 N［92］、PVY 抗 性 基 因Va［93］、根结线虫抗性基因Rk［94］、根黑腐病抗性基因［95］等都开发了相应的的分子标记，并应用于育种实践。近年来，我国在关键基因定位挖掘方面取得了较大成就，并逐步赶上甚至超越国外相关研究。但仍要加大基础研究力度，充分将基因组学、分子生物学的最新研究成果与种质创新有机结合，利用最新的基因编辑技术改良创新优良种质，同时利用最新的分子标记开展高通量标记检测以及关键基因定位和克隆，为种质创新和分子标记辅助育种奠定基础。
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