RNAi技术在虾免疫和生长发育的研究进展

陈田聪，吕敏，卢小花，谢达详

（广西壮族自治区水产科学研究院，南宁 530021）

虾类种类多样，适养殖品种诸多，然而虾类养殖中出现了诸多问题，如野田村病毒、白斑病等疫病暴发，虾类性别生长差异明显，生长发育和生殖产生环境应激反应，给产业带来了巨大损失，必须从基因功能及调控机理上寻找新的途径。应用分子测序技术，不同组织、不同发育时期的虾蟹类的mRNA序列不断被检测出来[1]，为研究虾类的生长发育、免疫蜕皮等生物学过程的分子机理提供了基础。

RNAi，又称基因敲除（Knock-down）或基因沉默（Gene silencing），指物种在进化过程中，高度保守的同源mRNA被双链RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）诱发和介导进行高效特异性降解，普遍存在真核生物中的转录后调控机制，对物种的生长发育、稳定转座子和抵御异源物侵入具有重要作用。RNAi首次在反义RNA阻断线虫（Caenorhabditis ele-gans）的part-1基因表达时意外发现正义RNA能抑制part-1基因表达[2]，研究part-1基因的正义、反义和dsRNA在线虫表达时进一步发现dsRNA沉默特定基因表达效果最好[3]。随后RNAi技术不断成熟，凭借特有的高效性、稳定性、特异性的优点被科学家迅速广泛运用到研究基因功能上来，并取得了众多研究成果。虾类属节肢动物门，由于处在无脊椎动物和脊椎动物进化地位之间，其生长发育过程、组织构造较为独特，而RNAi机制普遍存在真核生物体，在调控虾类动物的生长发育和免疫应答等生物学过程中也具有重要地位，因此，该文综述了RNAi技术在虾类抗病毒免疫、生长发育、蜕皮的研究进展，为深入解析虾类在3个重要生物学的功能基因和RNAi技术应用调控虾养殖中面临的棘手问题提供参考。

1 免疫

白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、黄头病毒（Yellow head virus，YHV）和桃拉病毒（Taura syndrome virus,TSV）三种病毒类型对虾养殖影响较大、危害较重、范围较广。研究发现，免疫系统是动物抵御异源有害物侵噬所形成的严密防御体系，根据获得的方式分为先天性免疫和获得性免疫，虾类作为甲壳动物，其自身体内缺乏产生免疫球蛋白机制，几乎不存在获得性免疫，仅具有先天性免疫[4-5]。虾遭受病毒侵染时，病毒基因结合至寄主的基因组内，宿主细胞转录翻译过程中会产生相应的dsRNA，其细胞内的核酸内切酶Dicer（DCR2）[6-7]与 Arsenite resistance 蛋白 2（Ars2）[8]和HIV-1反式激活应答元件RNA结合蛋白（HIV-1transactivating response（TAR）RNA-binding protein，TRBP）[9]组成三者复合物，将产生的 dsRNA 分割成与宿主细胞内的核酸内切酶Argonautes 2（A－go2）结合组成沉默复合物的siRNA，切割降解病毒的mRNA，抑制病毒基因的表达和复制，抵御病毒感染[10]。在虾类动物中，RNAi技术应用伊始是在免疫方面。Kim等人首次将绿头鸭（Anas platyrhynchos）、鲶（Ictalurus punctatus）和野猪（Sus scrofa）3种脊椎动物的免疫球蛋白基因dsRNA注射入感染WSSV和YHV的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）发现，实验组经注射异源物种dsRNA后病死率下降，结果表明，虾类作为无脊椎动物缺乏免疫球蛋白基因，所注射的3种脊椎动物的免疫球蛋白基因dsRNA不可能参与该虾抗病毒免疫系统，3种外源性dsRNA通过激活其先天性免疫机制起到抗病毒作用是减少凡纳滨对虾死亡的原因[11]。

1.1 WSSV

3种类型病毒中危害最严重的是WSSV，给国内外虾养殖产业造成的损失不可计数。WSSV是一种双层囊膜状杆状型双链病毒，VP19、VP24、VP26、VP28等10余种膜蛋白迄今已被发现[12-13]，WSSV病毒粒子的吸附、入侵、包装和释放等关键过程通常涉及到这些膜蛋白，可应用RNAi技术定向沉默编码这些病毒蛋白质mRNA抑制其拷贝[14-15]。将携带WSSV的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）注射VP28和VP281的长链dsRNA[16]、WSSV的日本对虾（Penaeus japonicus）注射VP28的短链dsRNA、WSSV的凡纳滨对虾注射VP28的dsRNA，病死率大大减少[17-18]。斑节对虾的Rab7可以与WSSV的VP28结合，在WSSV感染机制中发挥作用[19]。

1.2 TSV和YHV

TSV和YHV与WSSV不同，是单链RNA病毒[20-21]，对于YHV，RNAi仅限于体外细胞中研究其gp116和gp64，对于YHV和TSV，诸多研究成果集中在阻断传输通路中的相关基因[22]。Rab7蛋白是研究RNAi干扰两种病毒常用蛋白，属于GTP结合蛋白家族Rab家族成员，病原体入侵宿主细胞后，被宿主Rab7蛋白特异识别结合，避开溶酶体的消化，不能介导晚期胞内体与溶酶体的膜融合，溶酶体转运过程受阻，导致宿主感染[18-19]。研究发现，TSV、YHV感染的斑节对虾注射Rab7的dsRNA，Rab7基因的表达量大大降低，病毒感染被有效抑制，另外，WSSV感染的斑节对虾注射Rab7的dsRNA，也有类似结果，推测Rab7蛋白可能参加了病毒复制过程中的内吞运输[23-24]。

RNAi作为一种完全、高效、无毒的抗病毒入侵的新技术，在虾类动物抗病毒方面彰显了重要作用，研究进展不断取得突破，研究层次不断深入到感染信号通路的调控和特定病毒基因表达的沉默，对控制病原体感染尤为重要。虽然RNAi干扰病毒感染过程的理论不断丰富，但开发和构建特定病毒长期性表达的特异RNAi体系，并应用到虾类动物养殖中是当前重要研究方向。

2 生长发育

RNAi作为现代分子生物技术，在甲壳类动物和脊椎动物的生长发育方面有着广泛应用，近来也在研究虾类动物生长发育不断取得显著成果[25-26]。一般生物生长发育包括正常的细胞增殖、组织生长、增重等生理现象。该文主要阐述了RNAi对虾体内的肌肉生成抑制素（Myostatin，MSTN）、表皮生长因子受体（Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR）、Hox基因（Omeobox genes）的作用。

MSTN、EGFR、Hox三种基因在虾类动物生长发育上具有重要地位，是其体质量增加、个体生长的关键基因。MSTN是控制肌肉生长的调控因子，是转化生长因子-β（Ttransforming growth factor-β，TGF-β）家族一员，又称生长分化因子（Growth differentiationfactor 11，GDF-11）[27]。有研究称，日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）的 MSTN/GDF-11基因在不同蜕皮时期的表达量不同，早期阶段表达丰度高，随后表达量降低，结果表明，MSTN/GDF-11基因参加了该虾生长发育的生物学过程[29]。对斑节对虾、凡纳滨对虾MSTN/GDF-11基因RNAi干扰结果发现，经长期（斑节对虾45 d、凡纳滨对虾56 d）干扰后，干扰组增重均大大低于对照组，且凡纳滨对虾出现较高的病死率（71%）[30-31]。总体来看，MSTN/GDF-11是促进虾类动物肌肉生长发育的基因。EGFR是一种跨膜蛋白分子，具有酪氨酸激酶功能，通过结合配体诱发细胞内信号通路依次激活，促进机体控制生长发育的细胞进行分裂增殖。对干扰罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）Mr-EGFR基因的研究结果表明，经13周之后，干扰实验组生长变缓，体质量大大低于对照组，Mr-EGFR是调控该虾生长发育重要因子[32]。Hox基因（Omeobox genes）是节肢动物躯体生长发育的重要引进，表达时遵守严格的胚胎发育的程序性、组织特异性，同源异型盒主要有 3 种：Ultrabithorax(Ubx)、Distal-less(Dll)、Spalt[33]。Spalt基因发现于卤虫体内，Dll基因发现于水蚤，两类基因在虾类研究较少[34]。对通过干扰明钩虾（Parhyale hawaiensis）附肢的生长发育Ubx基因研究发现，干扰后，Ubx、Dll基因表达量减少，附肢表型发生变化[35]，表明Ubx可能是参与了明钩虾附肢的发育过程。

机体生长发育是一个涉及多个基因和调控信号通路的复杂有序的生物学过程。目前，虽然RNA干扰虾类动物的生长发育分子机制取得一定研究成果，但与其他甲壳类相比，特别是陆生类，RNAi技术应用依然需要很长的路要走。生长发育作为虾类最基本的生物发育过程，更多的生长发育基因需要挖掘，诸多的信号通路机制需要搞清，而RNAi和其他分子技术在此研究过程中是必不可少的辅助技术。

3 蜕皮

虾类属于水生甲壳动物，其身体组织和构造独特，与其他水生动物、陆地甲壳类动物相比，蜕皮现象也比较特殊，目前主要发现六种蜕皮因子：甲基法尼酯（Methyl farnesoate，MF）、蜕皮抑制激素（Molt Inhibiting Hormone，MIH）、蜕皮激素（Ecdysteroids，E）、蜕皮激素受体（Ecdysone receptor，EcR）、维甲酸X 受体（Retinoid X receptor，RXR）、转录因子调控蜕壳响应基因E75和几丁质酶[36-37]。对用dsRNA沉默红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）Cq-MIH 基因、干扰日本沼虾的Mn-MIH基因的研究结果发现，干扰后，相比对照组，蜕皮周期加快，蜕皮频次增加，MIH是虾类动物蜕皮周期中的负调控因子[38-39]。此外，有研究发现，EcR正调控MIH基因的表达，是MIH基因上游调控因子，RNAi研究证实，虾类动物的蜕皮机制与其他甲壳类相似，一般通过“E→EcR→MIH”信号通路机制调控蜕皮[40]。RXR是甲壳类动物蜕皮重要调控因子，RXR与EcR结合成二聚体结构形式，调控下游E75基因的表达水平[41]。注射dsRNA对中国对虾幼虾体内RXR的干扰后，下游Chi、Chi-1几丁质酶基因及E75基因的表达水平降低，推断RXR是参加了虾类蜕皮信号通路的基因[42]。通过持续注射E75-dsRNA，结果发现，中国对虾的蜕皮受阻，表明E75基因作为必需基因参与了虾类动物蜕皮调控[43]。用RXR、EcR和E75基因的dsRNA干扰凡纳滨对虾，沉默任意一个基因，会诱发其他两个基因的表达丰度均发生改变，蜕皮通路和与生长发育相关基因受到影响，进一步证实了RXR、E－cR和E75基因是调控虾类动物蜕皮过程的必需基因[44]。MF是虾体内一种承担调节体节发育、生长和生殖的重要生长调控因子，MF的生成主要通过甲基法尼酸甲基转移酶（Farnesoicacid O-methyltransferase，FAMeT）催化法尼酸转化而成[45-46]。对凡纳滨对虾注射FAMeT基因的dsRNA，FAMeT降低了表达量，蜕皮时间延迟，与蜕皮相关的组织蛋白酶、血蓝蛋白的基因表达水平下调，实验组因蜕皮阻滞全部死亡，对照组则未发现死亡，结果表明，FAMeT基因是虾类动物生长、蜕皮的重要信号因子[47]。

蜕皮是虾类动物生长和发育的标志性特征，是一个严谨复杂的生物学过程。它贯穿于甲壳动物个体发育的始终，受MIH信号通路、Ca2+信号通路以及NO信号通路的共同调节[48]。目前对蜕皮机制的认识还相当有限，各信号通路直接是否存在关联，以及每条信号通路都存在哪些具体的调控因子，这些都需要进一步研究。

4 展望

RNAi技术与 TALEN、ZFN、CRISPR/Cas9h等基因组编辑技术作为现代研究基因功能的辅助分子工具，已经广泛应用于水产动物。基因组编辑技术主要借助显微注射技术对细胞系或者胚胎基因组DNA进行操作。截至目前，由于虾作为甲壳动物，其卵壳较硬易碎，且相应的成熟细胞系构建体系缺乏。因此，运用基因组编辑技术挖掘虾类基因功能的相关文章鲜有报道。未来基因组编辑技术是基因功能挖掘的发展趋势，目前来说，在技术成熟和功能上，RNAi技术更完善，优势更显著。尽管RNAi操作过程中会出现脱靶和效应剂量等的问题，然而，可以通过筛选找出最佳靶点和合适剂量的dsRNA。与脊椎动物、其他类甲壳类动物相比，虾类由于体型较小，所需dsRNA注射用量较少，现有开发出的RNAi试剂盒可以满足实际科研实验要求，并且可节约成本。另外，人工合成的dsRNA可持续在生物机体内发挥作用的优点。研究结果表明，人工合成的斑节对虾体GIH-dsRNA在其体内的有效作用时间可达30 d以上[49]。注射法是研究RNAi机制的主要转染方法。最近报道了卤虫饲喂法，用卤虫滤食富集斑节对虾GIH-dsRNA的大肠杆菌，将该卤虫作为饵料投喂斑节对虾，可引起GIH基因的表达丰度降低[50]，该方法简单方便有效，特别是对不适用注射法的虾类幼体而言，为应用RNAi技术挖掘幼体发育时期的功能基因提供了技术基础。

RNAi是生物机体内生的抗病毒免疫机制，在抵御病毒浸染中具有重要作用，然而，目前其在虾类动物免疫生理过程中的具体分子机制尚未完全搞清。经病毒诱导的昆虫、蟹类可在自身体内独立生成抗病毒的siRNA和miRNA，且各自免疫功能特异[51-53]。由于虾类特殊的生境形成了自身特有的组织构造和功能基因，其独有的siRNA和miRNA是独立作用机制还是协同机制以及具体分子机制尚需进一步研究。借助RNAi技术搞清危害虾类养殖中病毒性疾病的发病原理，寻找出科学合理的防治方法和高效药物，促进虾类养殖业健康发展。虾类动物的各个生物学过程相互依存，相互关联。甲壳动物的生长发育与蜕皮现象相辅相成，生长发育导致了蜕皮现象，蜕皮也是生长发育的必经环节，促进了机体的生长。蜕皮和生长发育之间基因信号通路各异却又相互连接，形成一个复杂的调控网络。因此，在探索基因组方向上，需要从挖掘单个基因或几个基因的功能转变到基因信号通路。基因测序技术挖掘了大量的基因信息，而RNAi通过精确定位沉默目的基因研究下游基因的表达量变化，进而从转录水平上研究和解读其信号通路。

综上所述，RNAi作为一种应用广泛、快速发展的现代分子技术，在蟹、节肢昆虫研究中已经展示了广阔应用前景。虾作为主要经济类水产养殖品种，随着对其RNAi信号通路机制的研究不断深入，基因功能及其调控网络不断被解读，不仅推动其基因组学的发展，也将为养殖技术和应用提供厚实的理论支撑，推动该产业健康发展。