Epac与神经系统疾病的相关性研究进展

刘 静 陶欣荣 杨 辉 张荣波

安徽理工大学医学院医学前沿实验中心，安徽 淮南 232001

cAMP直接激活的交换蛋白(exchange protein directly activated by cAMP，Epac)也称cAMP-鸟嘌呤交换因子(cAMP-GEF)。1998年，由DE ROOIJ等[1]首次发现。同年，Epac的两种异构体被发现，即Epac1(cAMP-GEF-Ⅰ)和Epac2(cAMP-GEF-Ⅱ)[2]。Epac作为cAMP的胞内受体，可以单独或与PKA联合接受cAMP作用。在中枢神经系统，Epac参与多种疾病的病理生理过程，包括精神分裂症、阿尔兹海默综合征、自闭症等。我们回顾了Epac与神经系统相关性的研究进展和动物实验结果，以Epac为靶点研究新的药物，可作为几种神经系统疾病新的治疗方法。

1 Epac的分布

Epac有两种亚型Epac1和Epac2。Epac1在体内分布广泛，主要在心脏、血管、肾、肺、脂肪组织、中枢神经系统、子宫等组织中表达。Epac2A、Epac2B以及Epac2C是Epac2的3种剪切变异体，其中Epac2A主要分布在胰腺、中枢神经系统以及内分泌组织，Epac2B则主要分布在肾上腺，而Epac2C主要在肝脏中表达。在亚细胞结构中，Epac1分布在细胞核周，Epac2A主要在细胞质中。PARNELL等[3]的实验也证实了这一点，将Epac1-HA或Epac2A-HA转染到HEK293T细胞中，通过免疫荧光共聚焦显微镜观察发现Epac1在核膜集聚，Epac2A则均匀分布在整个细胞。

2 Epac的结构和功能

2．1 Epac的结构Epac的异构体Epac1和Epac2拥有相似的结构特点，由C端的催化域和N端的调节域共同构成的一种多结构域的蛋白。C端的催化域携带CDC25域，通过REM及RA域稳定空间结构。REM域能够将GDP转化为GTP，RA域则可将CDC25域与REM域分离开。N端的调节域包括膜锚定蛋白DEP域和高亲和力的cAMP-B域。DEM域主要作用在于调节Epac1重新分布到质膜上，这一过程中cAMP-B域起辅助作用，进一步提高了Epac1质膜定位的准确性。此外，通过对Epac2基因敲出的小鼠重新导入外源的Epac2发现，Epac2A主要存在于胰岛细胞的质膜附近，而Epac2B主要在细胞质中，单独将cAMP-A域导入细胞后也定位在质膜附近[4]，进一步证明了N端 cAMP-A域在亚细胞定位的过程中也发挥了重要的作用。Epac1和Epac2两者结构的差异主要在于Epac2的N末端有环状核苷酸结合域(cyclic nucleotide-binding domain，CNBD)[5]，CNBD1能够降低环磷腺苷的亲和力 。

2．2 Epac的功能Epac在体内的广泛分布导致其功能的多样性。神经系统中Epac可以增强突触的传递，参与调节神经递质的释放[6]。Epac联合PKA协同作用诱导神经元的分化[7]，cAMP/Epac信号通路加强脑内出血的的炎症反应[8]。另外，Epac1能够抑制肝星状细胞的增殖[9-10]，从而进一步抑制或逆转肝纤维化的过程。Epac2A缺失引起的葡萄糖刺激胰岛β细胞分泌胰岛素受损[11]，GLP-1受体激动剂利拉鲁肽和格列美脲合用会降低胰岛素分泌，而Epac2A(+/+)小鼠的胰岛素分泌增强[12]。激活的Epac1可以减弱离体培养内皮细胞的渗透性，Epac1的选择性激动剂能够减轻血管炎症反应。此外，Epac参与了癌细胞的迁移[13]，敲除Epac能够抑制卵巢癌细胞的增殖[14]。除上述功能外，Epac还参与细胞内的多种反应，如钙离子的触发、胞吐、细胞连接的形成等。近年来有研究发现，T细胞Epac1缺失可以导致SMAD7蛋白水平增加，减少SMAD4的表达同时能够抑制SMAD2的磷酸化以应对TGFβ1的治疗[15]。

3 Epac与神经系统疾病的相关性

3．1 Epac与精神分裂症精神分裂症是一种多因素引起的破坏性精神类疾病，常表现为幻觉、精神错乱、社交退化、情感扁平化等。cAMP级联反应可以调控一系列中枢神经系统过程，cAMP主要通过刺激环核苷酸门控通道(CNGC)、PKA以及Epac参与机体活动[16-17]。虽然对PKA做了很多研究，但目前对Epac在中枢系统的功能了解甚少，但有相关研究表明，cAMP的下游分子Epac可能与精神分裂症有关，主要通过调节整合素和Gas蛋白影响精神分裂症的病理过程。

Epac/Rap1信号通路可以激活整合素信号传递诱导整合素介导的细胞黏附，阻断整合素信号传递与精神分裂症密切相关。有学者发现，在Ovcar3 细胞中加入Epac激动剂后，贴壁细胞的百分比上升明显，细胞的黏附力增强[18]。整合素是细胞黏附分子，在大脑发育和维持大脑功能中扮演至关重要的角色。细胞黏附分子基因的点突变可能会改变配体的结合，从而增加精神分裂症的易患性。日本科学家SUPRIYANTO等[19]选择中枢神经系统中细胞黏附分子的15个基因位点检测其与278例精神病患者和284名正常人的关联性，发现ITGA8基因(整合素基因)与精神分裂症密切相关。有学者研究发现，缺乏整合素信号传递的小鼠将导致精神分裂症的相关表型[20]。由此我们推断，Epac/Rap1信号通路通过介导细胞黏附的过程，从而进一步促进或抑制精神分裂症的发生、发展。

Epac能够调控Gas蛋白。Gas是G蛋白的亚单位，Gas在体内过表达将导致成人精神分裂症的相关表型，表现为惊反射的前脉冲抑制实验(prepulse inhibition of acoustic startle，PPI)异常。AVISSAR等[21]通过分析正常人与未经治疗的精神分裂症患者的单核细胞后发现，精神分裂症患者的Gas信号通路明显提高。以此为基础，KELLY等[22]通过转基因技术建立动物模型使Gas在小鼠体内过表达，与对照组相比，Gas组小鼠PPI明显偏低。通过检测转基因小鼠海马齿状回、CA1区等脑区Gas mRNA的表达水平明显提高，进一步检测后发现，在Gas过表达的小鼠海马皮质、海马、前额皮质cAMP水平显著下降。cAMP水平的下降进而引发对下游分子Epac的激活减少。治疗精神病的药物均可提高C57BL/6J的 PPI，通过使用Epac的激动剂8-pCPT-2’-O-Me-cAMP明显提升了PPI，说明Epac在精神分裂症是一个关键的靶点。

3．2 Epac与阿尔兹海默综合征阿尔兹海默综合征(Alzheimer's disease，AD)是临床常见的一种与年龄有关的神经退行性疾病，发病早期较为明显的症状主要是记忆力减退并伴大脑神经元的变性，进而逐步发展为自理能力及认知功能障碍，引起严重的痴呆，最终导致患者死亡。

Epac通过调控miR-124在AD过程中起重要作用。在AD患者前额皮质中，Epac1上调，Epac2下调。在神经炎症小鼠模型中发现Epac1蛋白的表达量上升。大量流行病学、临床医学已表明，散发性AD是由慢性脑灌注不足导致的血管障碍。微小RNA(miRNA)是低氧应激反应的理想介质，促进细胞对长期低氧的适应。AD患者脑中miR-124表达下降[23]。Epac能够抑制miR-124的转录，主要通过激活Ras样小GTP酶Rap1或Rap2。将Epac(+/+)或Epac(-/-)神经元(DIV16)分别用20 mmol/L 8-pCPT-Me-cAMP处理6 h后，Epac(+/+)组明显减少了miR-124的转录(P<0.01)[24]。在慢性脑灌注不足的情况下，miR-124下调可通过Epac/Rap1通路的激活。ZHANG等[25]发现，在慢性脑灌注不足动物模型中，术后90 d后与假手术组相比，海马内Epac1和Epac2分别上升了1.5倍和4倍，Rap上升了30%。另外，在体外培养的神经干细胞中加入Epac激动剂，6 h后检测Rap1的活性上升了30%，而miR-124的表达下降到22%。也有研究发现，Epac可以通过控制miR-124影响小鼠的空间记忆和社会交往[24]。因此，阻断Epac/Rap1信号通路，可能减缓AD的发病进程，减慢记忆力损伤，缓解临床症状。

近来，有学者研究发现，在东莨菪碱导致的痴呆模型中，通过Epac/miR-124/Egr1信号通路调控褪黑素合成，进而减轻突触紊乱[26]。AD患者血清中褪黑素水平下降，补充褪黑色素能够逆转AD的病理和记忆力缺陷。Epac/Rap1通路和Epac/miR-124/Egr1信号通路调节miR-124在AD发病过程中发挥作用，但其具体的机制仍不清楚。

3．3 Epac与自闭症自闭症多见于儿童，常见症状为社会交往、语言交流和重复行为的缺陷，是一种包括遗传因素在内的由多种不明原因引起的神经发育障碍，近年来发病率稳步增长[27]。也有报道发现，母亲免疫力的激活也会增加儿童自闭症的风险和严重程度[28]。

异常的突触功能及树突结构的减少导致神经元发育障碍，是自闭症病因的一个重要组成部分。Epac2罕见的编码变异能够引起自闭症，DEEPAK等[29]通过对孕C57BL小鼠子宫内的胚胎进行电穿孔使2/3层处的皮质神经元的Epac2被敲出，损伤Epac2与Ras之间的相互作用，影响Ras-Epac2-Rap通路，从而减少了基底树突的结构，选择性减少皮质锥体基底树突的复杂性。HUTSLER等[30]研究发现，在自闭症患者脑组织皮质2/3层的皮质神经元顶端树突的数量增加，揭示了顶端树突的数量与认知的功能成反比。这些发现提示，Epac2能够调节皮质神经元2/3层神经元的树突结构，进而影响自闭症的发病进程。

4 结语

神经系统疾病一直是现代医学治疗的难点，给人们的正常生活带来了重大压力及经济损失。但关于Epac与神经系统的相关性研究近年来还较少，Epac作为cAMP下游重要分子，可能在精神分裂症、阿尔兹海默综合征、自闭症等多种神经系统疾病起着重要作用。Epac功能的多样性增加了我们的研究兴趣，但其在神经系统疾病方面的具体发病机制还不十分清楚。对Epac的深入研究，尤其是Epac对神经元突触结构的影响及机制研究，为解决神经系统疾病治疗的难点提供有效的治疗靶点和途径。

[1] DE ROOIJ J，ZWARTKRUIS F J，VERHEIJEN M H，et al．Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP[J]．Nature，1998，396(6 710)：474-477．

[2] KAWASAKI H，SPRINGETT G M，MOCHIZUKI N，et al．A Rap guanine nucleotide exchange factor enriched highly in the basal ganglia[J]．Science，1998，282：2 275-2 279．

[3] PARNELL E，SMITH B O，YARWOOD S J，et al．The cAMP sensors，EPAC1 and EPAC2，display distinct subcellular distributions despite sharing a common nuclear pore localisation signal[J]．Cell Signal，2015，27(5)：989-996．

[4] NIIMURA M，MIKI T，SHIBASAKI T，et al．Critical role of the N-terminal cyclic AMP-binding domain of Epac2 in its subcellular localization and function[J]．Cell Physiol，2009，219(3)：652-658．

[5] DE ROOIJ J，REHMANN H，VAN TRIEST M，et al．Mechanism of regulation of the Epac family of cAMP-dependent RapGEFs[J]．Biol Chem，2000，275(27)：20 829-20 836．

[6] ALONSO B，BARTOLOME-MARTIN D，FERRERO J J，et al．CB1 receptors down-regulate a cAMP/Epac2/PLC pathway to silence the nerve terminals of cerebellar granule cells[J]．Neurochem，2017，142(3)：350-364．

[7] MUNOZ-LLANCAO P，DE GREGORIO C，LAS HERAS M，et al．Microtubule-regulating proteins and cAMP-dependent signaling in neuroblastoma differentiation[J]．Cytoskeleton (Hoboken)，2017，74(3)：143-158．

[8] LUO X，ZHU Q，ZHANG J，et al．The Double Roles of the Prostaglandin E2 EP2 Receptor inIntracerebral Hemorrhage[J]．Curr Drug Targets，2017，18(12)：1 377-1 385．

[9] YANG Y，YANG F，WU X，et al．EPAC activation inhibits acetaldehyde-induced activation and proliferation of hepatic stellate cell via Rap1[J]．Can J Physiol Pharmacol，2016，94(5)：498-507．

[10] SCHIPPERS M，BELJAARS L，POST E，et al．Upregulation of Epac-1 in Hepatic Stellate Cells by Prostaglandin E2 in Liver Fibrosis Is Associated with Reduced Fibrogenesis[J]．Pharmacol Exp Ther，2017，363(2)：126-135．

[11] HWANG M，GO Y，PARK J H，et al．Epac2a-null mice exhibit obesity prone nature more susceptible to leptin resistance[J]．Int J Obes，2017，41(2)：279-288．

[12] TAKAHASHI H，SHIBASAKI T，PARK J H，et al．Role of Epac2A/Rap1 Signaling in Interplay Between Incretin and Sulfonylurea in Insulin Secretion[J]．Diabetes，2015，64(4)：1 262-1 272．

[13] KUMAR N，PRASAD P，JASH E，et al．Insights into exchange factor directly activated by cAMP (EPAC) as potential target for cancer treatment[J]．Mol Cell Biochem，2018，5：1-6．

[14] GAO M，MA Y，BAST R C，et al．Epac1 knockdown inhibits the proliferation of ovarian cancer cells by inactivating AKT/Cyclin D1/CDK4 pathway in vitro and in vivo[J]．Med Oncol，2016，33(7)：73．

[15] ALMAHARIQ M，MEI F C，WANG H，et al．Exch-ange protein directly activated by cAMP modulates regulatory T-cell-mediated immunosuppression[J]．Biochem J，2015，465(2)：295-303．

[16] INSEL P A，MURRAY F，YOKOYAMA U，et al．cAMP and Epac in the regulation of tissue fibrosis[J]．Br J Pharmacol，2012，166(2)：447-456．

[17] ROBERTS O L，DART C．cAMP signalling in the vasculature：the role of Epac (exchange protein directly activated by cAMP)[J]．Biochem Soc，2014，42(1)：89-97．

[18] RANGARAJAN S，ENSERINK J M，KUIPERIJ H B，et al．Cyclic AMP induces integrin-mediated cell adhe-sion through Epac and Rap1 upon stimulation of the beta2-adrenergic receptor[J]．Cell Biol，2003，160(4)：487-493．

[19] SUPRIYANTO I，WATANABE Y，MOURI K，et al．A missense mutation in the ITGA8 gene，a cell adhesion molecule gene，is associated with schizophr-enia in Japanese female patients[J]．Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2013，40：347-352．

[20] BOUVARD D，BRAKEBUSCH C，GUSTAFSSON E，et al．Functional consequences of integrin gene muta-tions in mice[J]．Circ Res，2001，89(3)：211-223．

[21] AVISSAR S，BARKI-HARRINGTON L，NECHAMKIN Y，et al．Elevated dopamine receptor-coupledG(s) protein measures in mononuclear leukocytes of patients with schizophrenia[J]．Schizophr Res，2001，47(1)：37-47．

[22] KELLY M P，STEIN J M，VECSEY C G，et al．Developmental etiology for neuroanatomical and cognitive deficits in mice overexpressing Gas，a G-protein subunit genetically linked to schizophrenia[J]．Mol Psychiatry，2009，14：398-415．

[23] SMITH P，AL HASHIMI A，GIRARD J，et al．In vivo regulation of amyloid precursor protein neuronal splicing by microRNAs[J]．Neurochem，2011，116(2)：240-247．

[24] YANG Y，SHU X，SHANG Y，et al．EPAC null mutation impairs learning and social interactions via aberrant regulation of miR-124 and Zif268 translation[J]．Neuron，2012，73(4)：774-788．

[25] ZHANG X，HUANG X，FANG C，et al．miR-124 Regulates the Expression of BACE1 in the Hippocampus Under Chronic Cerebral Hypoperfusion[J]．Mol Neurobiol，2017，54(4)：2 498-2 506．

[26] WANG X，WANG Z H，WU Y Y，et al．Melatonin attenuates scopolamine-induced memory/synaptic disorder by rescuing EPACs/miR-124/Egr1 pathway[J]．Mol Neurobiol，2013，47(1)：373-381．

[27] YE B S，LEUNG A O W，WONG M H，et al．The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children[J]．Environ Pollut，2017，227：234-242．

[28] PATEL S，MASI A，DALE R C，et al．Social impairments in autism spectrum disor-der are related to maternal immune history profile[J]．Mol Psychiatry，2017 Oct 10．[Epub ahead of print]

[29] SRIVASTAVA D P，WOOLFREY K M，JONES K A，et al．An Autism-Associated Variant of Epac2 Reveals a Role for Ras/Epac2 Signaling in Controlling Basal Dendrite Maintenance in Mice[J]．Plos Biology，2012，10(6)：e1001350．

[30] HUTSLER J J，ZHANG H．Increased dendritic spine densities on cortical projection neurons in autism spectrum disorders[J]．Brain Res，2010，1 309：83-94．