microRNAs： 支气管哮喘的潜在新靶点

贺琳娟，刘姬艳

作者单位：310036 杭州师范大学生命与环境科学学院

支气管哮喘（简称哮喘）是以持续的气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性呼吸道疾病，有多种细胞及细胞组分的参与，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T 淋巴细胞及肥大细胞等炎症细胞，气道上皮细胞、平滑肌细胞等气道结构细胞和 IL-4、IL-9、IL-13、FOXP3 转录因子、TNF-α 等细胞组分[1]。哮喘临床出现反复发作的呼吸道症状，如反复的喘息、气急、胸闷、咳嗽等[2]。据统计，全球3 亿人患有哮喘，每年有 25 万人死于该病。发达国家如澳大利亚、英国、加拿大的哮喘患病率高达 10% 以上[2]，我国的哮喘患者也逐年增加，尤其是儿童哮喘患者，已经从2000 年的 1.97% 增加到了 2010 年的 3.01%[3]。

由于哮喘病因和发病机制的复杂性，给患者的准确诊断和有效治疗带来了困难，目前哮喘的诊断主要依据喘息的病史、发作的临床表现以及结合肺功能测定，但由于间隙性喘息和咳嗽也发生在非哮喘的其他呼吸系统疾病，而肺功能测定需要患者配合，不适合低龄儿童，因而对哮喘的准确诊断造成困难[4]。哮喘的治疗一般以药物控制为主，如吸入糖皮质激素（ICS）、β2-受体激动剂、白三烯调节剂等，但长期口服激素会诱发骨质疏松、糖尿病、肥胖症等不良后果，白三烯调节剂只能部分预防运动诱发的支气管痉挛[5]，故哮喘的诊断治疗还需要寻找有效的新靶点。

microRNA（miRNA），是一类长 18 ～ 25 个核苷酸的内源性非编码 RNA 分子，在各物种间具有高度的进化保守性、基因表达时序性和组织特异性等特点[3,6]。miRNA 的作用机制包括三种，两种是经典的调控方式：靶 miRNA 的5'UTR 与靶 mRNA 的 3'UTR 完全互补配对时，靶 mRNA被 RNA 诱导沉默复合物（RISC）特异性降解；靶 miRNA的 5'UTR 与靶 mRNA 的 3'UTR 不完全互补配对时，抑制靶 mRNA 的翻译，但不影响 mRNA 的稳定性[7-8]。另一种是 2017 年新发现的调控方式：miRNA 指导其靶向mRNA 快速脱腺苷化，导致 mRNA 的快速衰减和表达水平的降低[9-10]。研究发现，miRNA 在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要的调控作用，并且与某些疾病的发生、发展存在着密切的联系，如肿瘤、肺结核、肺血栓、心血管疾病等[3,11-12]。本文就 miRNA 在哮喘树突状细胞、T 淋巴细胞中的作用，在哮喘气道炎症和气道重塑中扮演的角色以及哮喘治疗方面的研究作一综述。

1 miRNA 指导哮喘树突状细胞的分化

树突状细胞（DC）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。肺部的 DC 细胞可以通过诱导调节性 T 细胞或 T 辅助细胞 Th1 来阻止对吸入无害性抗原的免疫应答，而 DC 细胞的功能和免疫性受到 miRNA 的严密调控[13-15]。

成熟的 DC 细胞能有效地激活初始型 T 细胞，在初始T 细胞分化的调节中起关键作用，同时诱导 Th1/Th2 型免疫应答的偏移[14]。脂多糖（LPS）诱导的 DC 细胞成熟可表现为 CD80 和 CD86 表达增强，Zhang 等[16]研究表明，let-7i 在 LPS 诱导的 DC 细胞成熟过程中上调，而 let-7i的下调明显阻碍 DC 细胞成熟，CD80 和 CD86 表达降低。Zech 等[17]研究表明，miR-155 在卵白蛋白或房尘螨诱导的 DC 细胞中表达上调，其缺陷直接影响过敏性气道炎症中 DC 细胞的成熟，CD80、CD83 和 CD86 的表达减少。

2 miRNA 指导哮喘 T 淋巴细胞的分化

T 淋巴细胞是哮喘调控的中枢效应细胞，哮喘的气道炎性与抗原特异性 Th2 细胞的形成有重要作用，而 miRNA可调节 T 细胞增殖、存活、活化、分化和细胞因子的产生[18]。

Zhou 等[15]提出，miR-155 能通过三大途径来调节 Th2炎症：一是通过预防 DC 细胞的抗原递呈；二是抑制 Th2细胞的分化；三是下调 Th2 细胞分泌 IL-4、IL-5 和 IL-13。Baumjohann 和 Ansel[18]研究发现，miR-155 缺陷型 T 细胞能产生更多的 IL-4、IL-5 和 IL-13 以及较少的干扰素 γ（IFN-γ），而 IL-4 特异性的转录因子 c-Maf 的表达增加可使 miR-155 缺陷型 T 细胞向着 Th2 细胞分化。Banerjee 等[19]发现，IFN-γ 对 CD4+T 细胞分化具有多效性作用，在 CD4+T 细胞活化后，IFN-γ 信号通过转录激活因子 1（STAT1）诱导 Th1 分化的关键转录因子 T-bet 的产生。T-bet 可以增强 Th1 细胞分化，抑制 Th2 细胞分化[20]。当 miR-155 过表达时，CD4+T 细胞向 Th1 分化，而抑制miR-155 的表达则可使 CD4+T 细胞向 Th2 分化。Lu 和Rothenberg[21]发现，IL-12 p35 的 3'UTR 含有高度进化保守的 miR-21 的靶序列，miR-21 的缺失会增加 IL-12 和IFN-γ 的表达；IL-12 是参与适应性免疫应答中 Th1 极化的关键分子，miR-21 可通过调节 IL-12 p35 的表达来调节Th1/Th2 的平衡，miR-21 缺陷的 CD4+T 细胞可向 Th1 分化。另有研究发现，体外 T 细胞中 miR-21 的过度表达促进了 Th2 细胞的分化，而在活化的 CD4+T 细胞中，miR-27 或 miR-128 的过表达则降低了 IL-4 和 IL-5 的分泌，促进了 Th1 细胞分化[22]。在过敏原刺激的 miR-155 KO 小鼠的气道中 Th17 和 Treg 细胞显著减少，表明miR-155 在体外调节 Th17 细胞和调节性 T 淋巴细胞Treg 的分化[23]。

3 miRNA 在哮喘气道炎症中的作用

哮喘作为具有遗传易感性的慢性气道炎症性疾病，近年来越来越多的证据表明，miRNA 参与哮喘气道炎症调节。

免疫学上认为哮喘的发生与 Th1/Th2 比例失衡相关，这种比例失衡导致多种炎性因子释放，最终引起哮喘气道炎症[24]。Rijavec 等[25]使用微阵列分析轻度、重度哮喘患者和非哮喘患者支气管活检样品中 let-7a、miR-21 和 miR-223三种 miRNA 的表达，结果显示三种 miRNA 在哮喘中差异表达，let-7a 在严重哮喘患者中下调，miR-223 在人类哮喘 T 细胞中下调；差异表达的 miRNAs 在气道炎症、Th1/Th2 极化和嗜酸性粒细胞的发育中发挥重要作用，还直接或间接地抑制一些关键因子的转录，如信号转导与转录激活因子 3（STAT3）、白细胞介素、IFN-γ、转化生长因子 β受体（TGF-β receptor）、Toll 样受体 4（TLR4）和血管内皮生长因子（VEGF）等。Simpson 等[26]研究表明，miR-17～ 92 簇（miR-17、miR-18、miR-19 和 miR-92），特别是miR-19a 可通过同时靶向 NF-κB、JAK-STAT 和 PI(3)K 途径的抑制剂来促进 Th2 细胞因子的产生，哮喘气道 T 细胞内 miR-19a 上调，增加了 IL-13 的产生，从而促进体内Th2 驱动的细胞炎症。Martinez-Nunez 等[27]的实验结果表明，miR-18a、miR-27a、miR-128 和 miR-155 在哮喘患者气道上皮细胞炎症中发挥作用，发现在支气管上皮细胞中miR-18a、miR-27a、miR-128 和 miR-155 同时下调可显著增加 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 水平。

Th2 气道炎症不仅表现为炎性细胞浸润，还伴随着支气管肺泡灌洗液中 Th2 细胞因子如 IL-4、IL-5 和 IL-13的增加[28]。Malmhäll 等[23]研究表明，Th2 细胞通过分泌Th2 细胞因子在变应性哮喘的发病机制中起关键作用，其中 miR-155 参与调节气道中过敏原诱导的 Th2 介导的嗜酸性粒细胞炎症。他们发现，miR-155 KO 小鼠嗜酸性粒细胞水平降低，黏液分泌增加，同时 Th2 细胞和细胞因子IL-4、IL-5、IL-13 减少，表现出 Th2 活化受损，表明miR-155 KO 小鼠中过敏性气道炎症减少是由于 Th2 细胞应答缺陷造成的。

4 miRNA 在哮喘气道重塑中的作用

在持续气道炎症中，由炎症细胞和气道平滑肌细胞产生的细胞因子和趋化因子使气道平滑肌增生，进而导致气道结构改变称为气道重塑[29-30]，气道重塑是哮喘的另一个主要特征。Dileepan 等[30]研究发现，在人体气道平滑肌细胞中，miR-708 和 miR-140-3p 对 TNF-α 刺激引起的炎症反应具有抗炎作用，也就是与 IL-17 促炎途径相关的一些组分被下调，而与细胞周期相关的一些基因上调，最终导致平滑肌细胞增生；miR-708 在抑制哮喘相关趋化因子 CD44 和CD38 的 mRNA 表达的同时还下调哮喘相关基因如ADAM33 和 RARRES2 的表达，miR-140-3p 则对趋化因子 CXCL12 基因具有显著抑制作用。

Ras 同源基因家族成员 A（RhoA）可介导细胞外调节蛋白激酶的磷酸化，促进嗜酸粒细胞的趋化，促进气道平滑肌细胞的增殖。IL-13 是支气管气道内一种主要的细胞因子，与支气管平滑肌的收缩有关，它能够通过转录激活因子6（STAT6）依赖机制增加 RhoA 的 mRNA，同时通过STAT6 独立下调 miR-133a 来增加 RhoA 的翻译，从而诱导 RhoA 蛋白上调。Chiba 和 Misawa[31]研究发现在哮喘支气管平滑肌细胞中 miR-133a 的下调会导致 RhoA 的上调，致使平滑肌细胞增殖；而当 IL-13 刺激支气管平滑肌细胞时，RhoA 的升高也伴随着 miR-133a 的下调，导致平滑肌收缩。

此外，过敏原诱导的炎症与哮喘患者气道重塑反应相关，Th2 细胞因子 IL-4 和 IL-13 在气道重塑中发挥重要作用。IL-13 对变应原诱导的哮喘患者具有直接的纤维化和气道重塑作用，并且能够调节噬酸细胞活化趋化因子和骨膜蛋白的产生。骨膜蛋白是一种细胞外基质蛋白，若在气道上皮细胞中表达增加，可通过基底膜增厚，上皮下纤维化和嗜酸性粒细胞炎症而导致气道重塑[23]。另有研究发现，IL-22能够作用于上皮细胞和气道平滑肌细胞，促进气道平滑肌的增生[32]。现有研究发现，miR-155 缺陷的小鼠不仅出现免疫受损，还表现出了与哮喘相似的气道重塑，在哮喘小鼠中miR-155 的表达下降，使 IL-13 表达上升，从而促进骨膜蛋白的产生[33]。

5 miRNA 在哮喘治疗中的潜在价值

目前在临床上治疗哮喘主要采用糖皮质激素和 β-2 受体激动剂。糖皮质激素和 β-2 受体激动剂可以通过控制气道炎症和舒张气道平滑肌改善患者的症状，但是副作用明显，如发音困难、骨质疏松、肥胖症、鹅口疮和心律失常等，还有一些患者对糖皮质激素不敏感[5]。此外，利用细胞或者细胞因子的单克隆抗体或拮抗剂等治疗哮喘也取得了很大进展。但是单克隆抗体较高的治疗费用严重制约了其在临床上的应用，且自体疫苗能否在体内有效产生抗体也是一个问题，其技术并未成熟[34]。

miRNA 在哮喘中具有潜在的治疗作用，可通过反义抑制或过表达 miRNA 来治疗哮喘。在 miRNA 过表达引起的疾病中，可用反义抑制法，反义抑制 miRNA 包括使用锁核苷酸修饰的反义寡聚核苷酸和胆固醇分子偶联的寡聚核苷酸结合 miRNA 使其失活。在 miRNA 表达下调所引起的疾病中，可使用 miRNA 类似物或成熟的 miRNAs 进行替代治疗[9]。

近年来，利用 miRNA 进行疾病治疗的研究逐渐增多。首个 miRNA 靶向药物——抗 miRNA-122 寡聚核苷酸已作为抗丙型肝炎病毒的药物进入临床试验[2]。有研究指出，选择性封闭 miR-126 可以抑制哮喘表型，使 Th2 反应、炎性反应、气道高反应、嗜酸粒细胞聚集和黏液分泌均减弱[6]。越来越多的 miRNA 被发现与哮喘疾病发展有关，从而使其成为最有潜力的治疗手段，且基于 miRNA 的治疗药物已进入临床试验期。

6 小结

虽然 miRNA 在哮喘发病机制以及治疗的研究仍旧处于起步阶段，但是目前已经发现一些 miRNA 在哮喘中被上调或者下调，这些 miRNA 可能有助于我们预测哮喘发病的靶点，也可以成为哮喘治疗的新方法。但是利用miRNA 治疗哮喘也有一定的危险性，尽管 miRNA 本身并没有毒性，但是其传递介质等可能引起其他作用，比如免疫反应的激活及不可预测的细胞分化等。因此还需更加深入地了解 miRNA 的功能，为利用 miRNA 治疗哮喘奠定基础。