肿瘤干细胞研究进展

潘有礼，赵成建，赵玉伟

作者单位：610213 成都，国家知识产权局专利局专利审查协作四川中心（潘有礼）；610041 成都，四川大学华西校区生物治疗国家重点实验室（赵成建）；610041 成都市血液中心（赵玉伟）

肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的重大疾病之一[1]。近年来，随着生物科技的进步以及肿瘤生物学的发展，肿瘤的临床治疗取得了显著的进步，但是绝大多数恶性肿瘤仍然无法从根本上消除，其中转移和复发是当前肿瘤治疗的最主要挑战。肿瘤干细胞是近年来肿瘤理论研究的热点之一，它被认为是肿瘤组织内真正驱动肿瘤发生和发展的“动力”，同时也是肿瘤复发和转移的根源。肿瘤干细胞可以很好地解释肿瘤细胞的异质性，由于肿瘤组织中存在肿瘤干细胞群体，而其具有很强的自我更新和分化能力，因而在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、耐药、转移、复发等方面起着决定性的作用。近年来肿瘤干细胞学说受到越来越多的关注[2-3]，并在白血病、乳腺癌、结直肠癌、脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离出了肿瘤干细胞。除此之外，研究人员还通过基因遗传谱系追踪技术对肿瘤细胞谱系进行了追踪，发现并证实了肿瘤干细胞的存在[4-6]。这些研究成果均为基于肿瘤干细胞的肿瘤治疗策略提供了理论基础。

1 肿瘤干细胞模型

肿瘤干细胞模型认为肿瘤干细胞为一群具有干细胞特性的细胞，其可以持续维持肿瘤的生长，并且肿瘤干细胞与正常的组织干细胞具有很多相似的特性，包括自我更新（对称和不对称分裂）和自我分化能力。肿瘤干细胞模型的一个重要应用在于它表明肿瘤细胞是分等级的，并且肿瘤干细胞位于等级的顶端。肿瘤干细胞模型的最早证据来源于急性粒细胞白血病[7]，该文献表明不同的白血病细胞亚群移植免疫缺陷老鼠后形成肿瘤的能力也是有差异的。其中大多数白血病细胞不能持续增殖，而少数表型为 CD34+CD38–的白血病细胞亚群可在 NOD-SCID 小鼠体内引发新的白血病，首次发现了白血病干细胞（LSC）的存在。随后，2003 年，Al-Hajj 等[8]在乳腺癌中发现 CD44+CD24–的细胞具有肿瘤起始能力。以上两个研究表明在肿瘤中只有少部分的细胞才有致瘤能力，并且一些瞄准肿瘤常规细胞的治疗并不能真正治愈肿瘤，因为上述治疗并不能消除肿瘤干细胞。其他研究采用类似的方法在其他肿瘤类型上进一步提供证据证实了肿瘤干细胞模型，包括结直肠癌[9]、胰腺癌[10]、脑肿瘤[11]和卵巢癌[12]。在以上肿瘤模型中，具有致癌能力的群体看起来限制在一小部分表型特异的细胞，而在成瘤实验中，需要注射很多未分群的细胞才能形成肿瘤，进一步表明成瘤细胞只占少数。以上研究还提示了大多数肿瘤都遵循肿瘤干细胞模型并且更有效的肿瘤治疗策略应该是靶向肿瘤干细胞。近年来，随着肿瘤学的发展以及研究的深入，学者们开始发现有些肿瘤的干细胞并不一定只占少数，在某些 B 细胞淋巴瘤、T 细胞淋巴瘤和急性髓系白血病（AML）中，肿瘤干细胞非常普遍[13]。在 B 细胞急性淋巴母细胞白血病中，至少 50% 的肿瘤细胞可以使野生型受体的老鼠发病[14]。在一些实体肿瘤中，肿瘤干细胞也可能占大多数，例如在黑色素肿瘤中，平均 30% 的肿瘤细胞可以形成肿瘤[15]。

2 肿瘤干细胞的起源

目前关于肿瘤干细胞的来源有多种观点，至今尚无定论。但普遍认可的有两种观点，一种认为肿瘤干细胞来源于正常干细胞，另一种则认为肿瘤干细胞来源于祖细胞。支持肿瘤干细胞来源于干细胞的理由主要有两点：其一，无限增殖是肿瘤细胞最显著的特征，显然已分化细胞缺乏这种能力，而干细胞的自我更新机制已被激活，维持这一活性比在已分化细胞中重新打开这一通路更容易；其二，干细胞较成熟细胞通常维持更长时间，不会在短期内死亡，而分化细胞则在细胞周期更新中较快地被新生细胞所替代，这就意味着干细胞相比已分化细胞存在更多累积突变的机会。在一些肿瘤中，学者们通过研究也证实了肿瘤干细胞来源于正常干细胞的突变[16]。另外，还有一些学者认为肿瘤干细胞是在定向祖细胞突变后获得自我更新能力时发生恶性转化产生的。例如，通过将 MLL 癌基因转入骨髓祖细胞可以导致急性髓性白血病的产生[17]，还可通过将 MOZ-TIF2 转化进鼠源的造血祖细胞以获得肿瘤干细胞[18]以及 Kras 突变和 p53 缺失的骨髓祖细胞能够变成肿瘤干细胞进而在体内产生AML[19]。

3 肿瘤干细胞的可塑性

肿瘤干细胞具有一定的可塑性，近几年的研究表明肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞在一定条件下可以相互转化[20-21]。在体外的细胞培养中，永生化的乳腺上皮细胞（HMECs）在转录因子 Snail 或者 Twist 的持续表达以及敲除E-cadherin 或者 TGF-β 的暴露下，HMECs 可以经历上皮-间质转化（EMT）而获得干细胞的特性[22]，这些细胞具有CD44+CD24–的表型，与乳腺癌干细胞的表型一致。在另一个研究中，研究人员在乳腺癌细胞系中分离出了干性、基底样或管腔状表型的细胞群落，而在体外条件下，3 个群落之间可以相互转化[20]。上述研究表明，非肿瘤细胞可以转化为肿瘤干细胞，因此，鉴定以及区分肿瘤干细胞变得更加困难与复杂，如果转化比例较低，那么仍然能够采用现有的表面标志物以富集或区分肿瘤干细胞，如果转化的比例较高，则难以区分肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞。

另一方面，微环境也能影响肿瘤干细胞的可塑性，例如在隐窝中的 WNT 配体对维持结肠癌干细胞的未分化状态是非常必要的[23]，而在结肠癌的起始阶段，微环境中的NF-κB 信号能够通过引发脱分化的方式来促进非肿瘤干细胞的肿瘤起始能力[24]。还有研究表明，在肿瘤异种移植试验中，WNT 信号水平与肿瘤的起始能力密切相关，位于肿瘤特定微环境中的成纤维细胞分泌的肝细胞生长因子（HGF）可以提高 WNT 信号水平、细胞的自我更新能力以及使肿瘤干细胞转化为非肿瘤干细胞[25]。

最近在人异种移植瘤开展的细胞敲除研究进一步证实了肿瘤干细胞的可塑性[26-27]，例如利用 CRISPR-Cas9 方法将 caspase9 基因的诱导型（iCasp9）插入到人结肠癌的LGR5 基因座位时可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而减少肿瘤细胞的体积。然而，一旦去除上述诱导物，肿瘤又开始重新生长，并且肿瘤的重新生长与处于有丝分裂静止的、已分化的肿瘤细胞的增殖密切相关。谱系追踪实验证实了表达KRT20 的已分化肿瘤细胞重新获得增殖潜能并同时恢复了LGR5+肿瘤干细胞的群落，从而显露了可塑性的端倪[26]。

4 肿瘤干细胞的代谢

基于氧化磷酸化的代谢对产生足以支持复杂组织运行的能量而言是至关重要的，通过以上过程还同时伴有活性氧的（ROS）生成，可以导致干细胞功能的紊乱[28]，因而传统观点认为干细胞会尽量避免氧化磷酸化而采用糖酵解的方式。代谢异常是肿瘤的一个标志并由此衍生了新的治疗策略，大多数的研究表明与正常组织相似的是，肿瘤也包含不同代谢类型的细胞群落，例如 KRASG12D突变的胰腺癌主要为糖酵解，通过下调 KRASG12D基因的表达可以使大多数肿瘤消退，然而少部分残留的肿瘤细胞仍会在 KRASG12D重新表达时介导肿瘤的复发，这些残留的肿瘤细胞显示了肿瘤干细胞的特性并依赖于氧化磷酸化（与大多数肿瘤细胞的代谢类型不同），进一步利用氧化磷酸化的抑制剂能够阻断其复发[29]。

一系列比较肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞代谢类型的研究结果显示两者并没有绝对通用的代谢类型，肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞主要采用糖酵解或氧化磷酸化进行代谢，其主要取决于肿瘤细胞的类型以及所用的肿瘤模型[30-31]。另外还有研究表明，肿瘤干细胞或非肿瘤干细胞的代谢类型在特定环境的刺激下具有可塑性，例如胶质瘤干细胞依赖于氧化磷酸化的代谢，但是当氧化代谢被抑制时又可转换为糖酵解的代谢方式[32]。深入的研究表明，EMT 与肿瘤干细胞代谢类型的转换密切相关[33-34]。

在肿瘤细胞的转移过程中，肿瘤细胞的代谢适应也扮演着非常重要的角色。有研究揭示了器官选择性地转移乳腺癌细胞展示出了不同的代谢类型，如选择性转移至肝脏的肿瘤细胞显示了谷氨酰胺和氧化磷酸化代谢的减少并同时将通过葡萄糖产生的丙酮酸转化为乳酸，这种代谢上的适应主要通过 HIF-1α 转录因子来介导[35]，因此肿瘤细胞转换为糖酵解的代谢方式有利于其转移至肝脏。尽管多数的研究主要关注肿瘤的葡萄糖代谢，目前有研究报道一些转移分散的肿瘤细胞可以通过脂肪酸来获取能量，该过程通过在高侵袭性的肿瘤干细胞群落中表达脂肪酸受体 CD36 来实现[36]。

5 肿瘤干细胞与上皮-间质转化

表皮样的肿瘤细胞可以转化为间质样细胞的状态以利于转移和侵袭，该过程被称之为上皮-间质转化。在过去几年里，关于肿瘤干细胞和 EMT 之间的关系引发了学者们的广泛关注[37-39]。通常而言，过表达 EMT 的转录因子不仅使细胞的转移能力增强，而且在细胞系中还增加了肿瘤的起始潜能。值得一提的是，肿瘤细胞中 Snai1（EMT 过程中的一个转录因子）表达水平的升高能够增强肿瘤起始能力和转移潜能[40]。在乳腺癌中，EMT 诱导下的肿瘤干细胞可以重现正常干细胞的间质样表型。

令人困惑的是许多上皮肿瘤的转移物仍保留表皮样的构造并缺乏间质样细胞的性质，该现象可能暗示转移性的肿瘤细胞在到达转移的新环境时立刻变为上皮状态[41]或者EMT 在某些环境下对肿瘤转移并不是必需的，例如上皮样的肿瘤细胞在不需要采用间质样的细胞状态时可以进行转移。为了支持上述观点，有学者在实验性的模型中将细胞锁定在 EMT 状态时发现其几乎不转移[42]，然而一旦通过敲除 EMT 的诱导者而恢复到上皮状态时，转移能力大大增强[43]。实际上，在乳腺癌移植物模型上的活体成像实验揭示了已经历 EMT 过程的转移性的细胞在到达转移位点时立刻回到上皮细胞的状态[44]。另外，有研究表明 EMT 的一个主要诱导因子 Twist1 的不同水平的表达能够在皮肤癌的鼠源模型中调节肿瘤干细胞的特性以及肿瘤的发生发展[45]。以上研究结果与 EMT 对维持肿瘤干细胞特性是必需的理论相冲突，并且暗示在多数环境下 EMT 与干性是相脱离的。

另外两个研究解释了产生上述差异可能的原因。首先，EMT 在肿瘤细胞中可能是短暂的，因为上皮肿瘤细胞在环境的刺激下变为间质样类型状态是可逆的，这些转换可能导致肿瘤干细胞表型的可塑性，例如在人乳腺癌细胞中非肿瘤干细胞与肿瘤干细胞间的转换主要依赖于 EMT 诱导者ZEB1，非肿瘤干细胞将 ZEB1 基因的启动子维持在二价染色体构象，其使细胞对来自微环境的 EMT 诱导物快速反应，因而提高了它们的肿瘤起始能力[46]。其次，Twist1 的瞬时表达使乳腺细胞趋于肿瘤干细胞状态，并且该状态在Twist1 活性消失且细胞已回到上皮状态后仍然持续着[47]。总之，上述研究表明在许多肿瘤类型中，肿瘤干细胞的等级制度并不是一成不变的。相反，肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞在环境刺激或随机状态下的相互转换可能是更普遍的生理现象。

6 肿瘤干细胞与肿瘤转移

肿瘤转移需要原位肿瘤细胞的脱落、侵袭血管或淋巴系统、迁移至不同的部位，然后进行细胞增殖并重组新的血管系统，关于肿瘤干细胞与肿瘤转移的关系有很多报道，然而目前还没有研究真正证实在异种移植实验中具有成瘤能力的细胞在生理条件下同样具有转移能力。一个根本性的问题在于转移能力是否仅局限于一群具有成瘤能力的细胞或者其起源于多数肿瘤细胞的基因或表观遗传学上的改变而与细胞的成瘤能力无关。一些研究已经表明胰腺癌[48]或结直肠癌[49]的成瘤细胞同样具有转移的能力，然而关于成瘤细胞与肿瘤转移之间的关系并没有进行系统地阐述，比如通过验证在肿瘤转移循环以及成瘤中发挥作用的所有肿瘤细胞。因此，关于非成瘤肿瘤细胞是否具有与成瘤细胞相似的转移能力以及在原位肿瘤中的非成瘤细胞是否可以在转移至新的环境时获得成瘤能力的问题仍需实验来进一步证实。

2009 年，Kalluri 和 Weinberg[50]通过研究提出了肿瘤细胞可以通过经历 EMT 的过程来获得转移能力。由于肿瘤细胞失去其表皮细胞的特性（比如细胞间的黏附和极性等）而获得间质细胞的特性，比如迁移、侵袭和抗凋亡等。EMT已被证实是乳腺癌细胞转移的一个必需步骤而且通过在体外诱导 EMT 过程可以使培养的细胞具有与成瘤的乳腺癌细胞相似的 CD44+CD24–的表型[22]。尽管肿瘤干细胞模型以及关于 EMT 的研究都集中关注于成瘤细胞和非成瘤细胞两者在表观遗传学上的差异，但是发生在基因上的不可逆突变也可使细胞具有转移能力，例如在某些类型的胰腺癌或神经管细胞瘤中，基因特异性的细胞克隆引发肿瘤转移[51-52]，这就提出了一个问题：到底是只有肿瘤干细胞能够通过基因上的改变而获得转移能力还是非肿瘤干细胞也能通过基因上的改变同时获得成瘤能力和转移能力？上述问题仍需通过体内的原位肿瘤实验来证实。

7 肿瘤干细胞与治疗抵抗

大多数的肿瘤治疗策略都集中于消除多数的肿瘤细胞，其中包括标准的抗肿瘤增殖的化疗和放疗等，然而它们所能带来的临床获益非常有限，往往化疗或放疗耐受的细胞能够导致肿瘤的复发，并且上述耐受的细胞被认为是肿瘤干细胞富集的群落。化疗或放疗的抵抗最初被认为是正常干细胞和肿瘤干细胞的内在特性，其可以通过多个独立的机制来产生，例如药物外排泵、DNA 修复能力或抗 ROS 能力的上调[53-54]。如下讨论的，细胞可塑性，特别是肿瘤干细胞进入休眠状态的能力已被证实为药物耐药的重要机制。

20 世纪 70 年代开展的关于血液肿瘤的研究工作指出，慢周期性的白血病干细胞能够导致肿瘤的复发[55]。研究者们发现白血病干细胞像多数正常的干细胞一样，在化疗后就进入细胞周期。而上述关于标准化疗后进入休眠状态的肿瘤干细胞引起肿瘤复发的理论目前进一步在实体肿瘤类型中通过遗传图谱的方法得到证实。有研究指出，奥沙利铂的治疗选择性地支持休眠克隆的生长，并且以上克隆在治疗后得到富集[56]；在神经胶质瘤的鼠源模型中慢周期性的肿瘤干细胞导致替莫唑胺的耐药，基因敲除上述细胞群落可以重新使神经胶质瘤细胞对化疗产生敏感性[57]；TGF-β 信号通路可以驱动转移性的乳腺癌细胞进入休眠状态。同样地，TGF-β 信号富集的微环境能够在鼠源的鳞状细胞癌中减慢肿瘤干细胞的增殖并进一步导致顺铂的耐药，遗传图谱分析实验阐述了以上静止的肿瘤干细胞在化疗结束后引起肿瘤的复发[58]。

在人胶质瘤模型中，肿瘤干细胞通过采用较慢的增殖状态来逃避抗细胞增殖的治疗，其主要依赖 Notch 信号通路和 H3K27 脱甲基酶 KDM6A/B 的表观遗传修饰[59]。在膀胱癌中，化疗激活静止状态的肿瘤干细胞，其反过来导致肿瘤的复发[60]。在乳腺癌和皮肤癌中，肿瘤干细胞的群落经历 EMT，其不仅与肿瘤迁移密切相关，而且还与抗增殖药物的耐药相关[58,61]。

还有研究表明，在增殖活跃的组织如胃和肠上化疗和放疗消除了快速增殖的干细胞和祖细胞，但是富集了处于细胞周期停滞状态的分化细胞[62-63]，而如上讨论的，这些分化的细胞通过可塑性的方式可以重新取代已消除干细胞的位置。这些研究表明，已分化的肿瘤干细胞后代也可能是化疗抵抗细胞的来源，而化疗抵抗细胞正是肿瘤复发的“推动者”。

8 肿瘤干细胞的靶向治疗

尽管细胞的可塑性使靶向肿瘤干细胞的治疗变得更加困难，但是一些药物公司已经开展了针对消除肿瘤干细胞的治疗项目。目前靶向肿瘤干细胞的治疗策略主要包括以下几种[28]：①抑制肿瘤干细胞的关键信号通路，如 WNT、Notch或 Hedgehog 通路；②通过抗体-药物的偶合物（ADCs）消除肿瘤干细胞，主要靶向肿瘤干细胞的表面标志物，如CD133、LGR5、CD33、DLL3 等；③表观遗传学的治疗，主要靶向表观遗传学的调节者，如 LSD1、HDACs、DOT1L、BET 蛋白、IDH1/2、BMI1 等；④靶向休眠状态的肿瘤干细胞，主要破坏其特异性的“依赖物”，例如代谢依赖性（如CD36）或 OxPhos 的抑制剂。

9 展望

大量的实验研究已经证实在多种肿瘤类型中存在着肿瘤干细胞，但是我们目前对其的认识还主要基于在异种移植的肿瘤模型上的观察结果。利用新的生物技术，例如CRISPR-Cas9、肿瘤类器官和活体成像等，可以为体内原位分析肿瘤干细胞提供新的方式，越来越多的研究开展针对肿瘤干细胞的研究并且不断地加深对肿瘤干细胞行为和生物学特性的认识，例如肿瘤干细胞并不一定是少数的、休眠和不可变的群体。另外，肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞之间的相互转化是目前靶向肿瘤干细胞策略中的一个主要挑战，进一步加深对肿瘤干细胞可塑性的认识将有助于开发新的针对肿瘤干细胞的治疗手段。在临床应用中，由于肿瘤干细胞与正常干细胞具有一定的生物学相似性，因而针对癌症的治疗在消灭肿瘤干细胞的同时又要避免伤害正常的干细胞。同时在急性白血病以及一些实体瘤中的研究发现，肿瘤干细胞对常规癌症治疗手段具有耐受性，因此开展肿瘤干细胞的新的筛选鉴定方法，进一步开发主要针对肿瘤干细胞的药物以及治疗方法对于癌症的临床治疗具有重要的意义。