PCR技术在食品微生物检测中的运用

□ 刘 杰 陈 璐 华测检测认证集团股份有限公司

微生物的含量在食品安全中有十分重要的作用，在近些年来，一些地方环境的污染导致原生的食物中含有一定量的污染成分，直接导致食品安全受到影响。在这些食品当中，存在的有害菌群远远超出允许范围值，甚至有些食物中存在微量的致病微生物[1]。食品安全和每个人的切身利益息息相关，是群众最为关心的民生问题之一，强化对食品的微生物检测工作既专业又有必要性。本文结合我国近年来在微生物的检测中做出的努力，深入探讨PCR技术如何在食品安全中起到把关的作用。

1 微生物检测的发展情况

我国的法律已经明确了对食品药品的检验方式，在食品的检测中对微生物的检测有着严格的限定和标准。在行业标准和国家标准的规定下，检测人员根据相应的物理和化学指标对食品进行抽样检测。根据微生物的菌群种类和含量进行比对区分，用检测的数据与标准相互对照，判定食品的质量，并且认定是否能够食用。但是，在日常的检测中常出现检测人员难以达到技术要求、检测仪器满足不了认定要求和对微生物种类判定存在疑问的情况。首先是在现有的条件下，能够具有较高专业素质和检测水平的人员数量与实际需求数量相差较大。在实验室环境中，要求检测人员工作细心，且能够在检测过程有较强的责任心，这对检测人员的素质有较高的要求。实验室处于无菌的环境，任何的失误和违规动作都会给试验结果带来不同的结果，直接导致实验结果的不真实、不可信[2]。此外，在检测中仪器的使用也是关键因素。按照标准对仪器进行定期的标定和校准，准备详细的实验仪器相关参数信息，以备在实验中随时使用，定期对仪器进行保养维护。尤其需要注意的是在极温环境下的仪器养护，过高温度、过低温度、湿度过大或者干燥的环境都要保证精密仪器的恒温恒压恒湿环境，这样才能保证仪器使用准确。对于微生物种类的判断也是检测的关键一环，每种微生物的检测标准和菌落培养方式不同，利用菌落的采集和稀释，得到培养基中的菌落成分。但是流程如此，在操作中就存在很多不方便之处，必须要求在操作过程中强化监督管理，确保流程合规。在传统的食物微生物检测中还是有很多的操作不足之处，使用PCR可以在很大程度上解决这些问题。

2 PCR技术的推广使用

2.1 在大肠杆菌检测中的应用

大肠杆菌作为食物中常见的菌类对人体危害较大，同时大肠杆菌的繁殖能力强，在有一定培养基础下都能进行大量繁殖。在传统的检测中，对于大肠杆菌较难检测出准确的数值。在使用PCR技术中，根据多重的筛选辨别后，利用贺毒素的靶向基因序列，对大肠杆菌的溶血细胞因子和多糖结构分子进行靶向标定。经过免疫的化学反应，最终得到多基因的类大肠杆菌，实验人员根据采集食物中的不同大肠杆菌数量，形成0157∶H7的比对基因序列，达到找寻大肠杆菌基因序列的目的，再使用血清法的比对参考，最终用PCR技术得到更为精确的检测结果[3]。

2.2 在幽门螺杆菌检测中的应用

幽门螺杆菌对人体的胃环境有较大的危害，长期菌群指标超标对胃黏膜有很强的迫害性。使用多重环境下的PCR技术，可以对螺杆菌的血清进行比对鉴定，对于基因中的脱氧核苷酸序列进行比对，利用异性基因的引物效应，重新构建新的PCR环境，在检测的比选中，根据多重的PCR技术和一重PCR技术相互对比，在两者出现较为明显的差异性时，可以判断出此时的菌类含量较高，食物不满足食用的标准。当两者比对相近时，利用基因的灵敏性研究结论，可以知道幽门螺杆菌处于静止未扩散的情况。利用此方式可以将禽类活体中的螺杆菌标记。实验结果显示阳性，则表示实际情况与实验结果相同，但是出现阴性，实验指标会发生调整。根据大量的实验结果证明，利用PCR检测标记的菌类有更高的准确率。

2.3 在金色葡萄球菌检测中的应用

金色葡萄球菌常常出现在蔬菜和水果当中，这类致病菌类在经过变异之后，一般农药很难杀除，而且在一般环境下会产生大量的繁殖，繁殖后产生SE类型的毒素，这类毒素给人带来最为直接的后果就是造成食物中毒。利用基因环境下的PCR检测技术，可以在蔬果中直接检测到金色葡萄球杆菌，利用线性核糖核酸的耐热酶效应，转为常规的基因序列，在免疫的条件下对菌类进行比对，根据不同菌类的灵敏度和特异度，从而实现PCR检测的真实性。在实际的操作中，PCR检测可以将检测的准确度控制在正负

1 pg的范围内。

2.4 在乳酸菌检测中的应用

乳酸菌是一种非致病菌，可生长在真空环境中。应用PCR 检测真空包装中的微生物可以明确食品腐败与否，影响到食品食用安全。有研究人员采用rRNA ISR 与16S rRNA 构建出PCR对真空包装中的牛肉相关腐败乳酸菌进行检测，还有检测人员使用变性梯度凝胶电泳法检测，得到的结果一致。均证明了随发酵时间延长检出率提高。实验过程构建出了PCR 有着较好的重复性，且解决了rRNA 不能重复检测泡菜中乳酸菌的问题。

3 PCR技术改进技术

在使用PCR技术过程中，对于微生物的环境要加以控制，包括在微生物的检测中，标准试验用品和对照标准都要严格遵照国家规范进行，以保证后期检验结果的真实性。在实验的过程中，利用PCR技术对质量的控制要使得结果和实验的操作相互对应，严格要求无菌环境下的比对基因方式。在此基础上衍生出PCR相关改良技术，对微生物的检测同样达到很好的检测效果。

实时定量PCR 技术，是将荧光基团加到PCR 反应系统中，运用荧光信号积累，对整个PCR 过程实时检测，最后用标准曲线定量未知模板，这种方法就叫实时定量PCR 技术。该法是在完全闭管情况下检测，而且结合此检测技术以及平稳无干预的荧光激发光源，在PCR 后不需再进行处理，有效防止交叉传染。该法运用缩短了检测周期，操作简便，检测时能做到准确、特异。给食品加工时检测外源DNA 受到污染的定量，在检测病原微生物、检测掺假量以及检测转基因食物等方面起到了有效作用。

4 结语

利用分子生物学技术检测食源性致病菌的方式发展迅速，尤其是PCR技术及在其基础上发展起来的众多新技术，可以使检测成本降低，效率更高，准确度更高。传统的检测方法检测致病菌需要经过生化和血清学等多个步骤，操作繁琐，耗时费力，灵敏度低，并且传统方法无法检测难以人工培养的微生物。PCR 反应的最大特点是扩增效率高和灵敏度高。本文还对实时定量PCR 技术进行简要的介绍，利用防止交叉感染的方式在避免出现污染的情况下有效地弥补了基础PCR技术在使用中的不足之处，更好地发挥PCR在食品微生物的检验效果。

[1]江飞,张旭伟.PCR 技术在食品检测中的应用和发展[J].河南农业2017(6):156-157.

[2]李富威,张舒亚,曾庆坤,等.乳制品中水牛乳成分的实时荧光PCR检测技术[J].2013(2):247-252.

[3]胡博.PCR 技术在食品微生物检测中的应用[J].现代食品,2017(4):36-37..