植物细胞质雄性不育和育性恢复基因调控机制研究进展

周小利，杨诗怡，陈志芸，索文龙，牛永志，马文广，廖菊够，顾 菁，陈穗云

（1云南大学云南省高校植物病虫害生物防控工程研究中心，昆明650091；2玉溪中烟种子有限责任公司，云南玉溪653100；3云南省烟草农业科学研究院，云南玉溪653100）

0 引言

植物雄性不育(male sterility，MS)是指雌配子正常发育，雄配子发育异常，能接受外来正常花粉受精结实的现象。目前为止，有610个植物种被报道存在雄性不育类型[1]，包括细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)，前者由线粒体基因偶联核基因共同控制，后者仅由核基因单独导致[2]。雄性不育植株一般表现为3种类型：一是花药退化和干瘪，仅花丝部分残存；二是花药内不产生花粉；三是产生的花粉败育。其中花粉败育可能是由于温度过低或者严重干旱等外界因素，使花粉母细胞不能正常进行减数分裂，导致不能形成正常发育的花粉；另外，绒毡层细胞异常，也会造成花粉败育。迄今为止，细胞质雄性不育现象己经在水稻、玉米、油菜、棉花、小麦、高粱、大豆等主要农作物和洋葱、辣椒、菜豆、向日葵等园艺作物中发现。杂种优势是杂合体在一种或多种性状上优于2个亲本的现象[3]，利用杂种优势产生了巨大的全球作物生产的经济效益[4]。在杂交育种实践中，利用雄性不育可以免去人工去雄节约劳力，是杂交种子生产的理想材料。利用胞质雄性不育系、恢复系和保持系的三系配套制种，已成为国际制种业的主要趋势，可节省大量的人力物力，并能提高杂交种子的纯度和杂交亲和性[5]。CMS已被广泛运用于玉米、水稻、油菜和向日葵等的杂交育种实践[6-7]，取得了良好的社会经济效益。

细胞质雄性不育(CMS)又称为核质互作雄性不育，由线粒体不育基因和核恢复基因(restorer of fertility,Rf)共同调控。细胞质线粒体基因产物导致雄性不育，而细胞核育性恢复基因(Rf)产物能改变线粒体中不育基因的转录或表达，使不育系恢复育性[8]。CMS不仅是植物生殖生物学研究中的一个重要性状，也是研究作物杂种优势利用的一个重要农艺性状，在作物育种和分子生物学研究中具有重要地位[9]，CMS系还是研究植物核质互作的理想模型。前人针对不同物种CMS的遗传调控机制开展了大量研究，希望能揭示CMS的作用机制和途径。以往的研究主要集中在形态学和细胞学等方面，近几年来，在分子生物学实验技术的不断发展下，植物基因组的研究也在不断深入，CMS分子机制的研究发展主要包括确定了细胞质雄性不育的相关区域，以及该区域相关的转录与翻译谱、细胞质雄性不育性的形成机制、恢复基因的作用机制及相关育性恢复基因的鉴定等方面[10]。CMS方面的研究主要是针对线粒体雄性不育基因的鉴定及其作用机制研究，细胞核育性恢复基因的鉴定，及其通过何种途径影响线粒体不育基因，并恢复育性。但多数研究都是针对某一个特定的物种而言，并没有系统介绍过有关植物细胞质雄性不育和育性恢复调控机制方面的内容。而且随着分子生物学的不断发展，更多的研究都注重育性恢复基因的克隆和鉴定，细胞质雄性不育形成的作用模型及育性恢复的调控机制研究甚少。

本研究系统总结了前人在细胞质雄性不育的机制和作用模型、细胞质线粒体不育基因、细胞核育性恢复基因鉴定、功能和作用途径，及二者互作机理研究方面的进展，以更好地指导将来对核质互作遗传调控机理的研究，从而使细胞质雄性不育系在杂种优势遗传育种中发挥更好的作用。

1 细胞质雄性不育的机制和作用模型

在CMS植株中，线粒体基因和核基因相互作用，控制植物的雄性特异性、育性发生和恢复。线粒体不育基因可能通过多种途径导致雄性不育：一是线粒体DNA重排，引起嵌合基因或新的orf表达，表达产物多为毒蛋白，这些蛋白产物影响线粒体呼吸链反应和绒毡层发育，导致雄性不育[11]；二是受异质的核背景可能导致线粒体呼吸链复合酶基因序列出现缺失、突变等，造成基因编码产物在氨基酸序列、亲疏水性和不同结构层次的改变，并影响线粒体电子传递链及氧化磷酸化过程相关酶的正常功能，造成雄性不育[12,13]；三则可能通过基因转录水平发挥作用，如研究指出线粒体编码蛋白产物的基因存在广泛的翻译后编辑现象，主要是C-U类型的编辑，这种翻译后编辑与雄性不育密切相关。根据细胞质雄性不育发挥作用的不同机制，前人提出了不同的作用模型，包括细胞毒害模型、能量缺乏模型和细胞程序性死亡模型等[9,14]。

1.1 细胞质雄性不育的细胞毒害模型

在细胞毒害模型中，CMS毒蛋白直接杀死正常细胞。第一次发现的CMS系毒蛋白是玉米CMS-T的urf13基因产物，该蛋白对大肠杆菌[15-16]和许多真核细胞有毒[17-18]。自从urf13被发现以后，一些CMS毒蛋白，如向日葵CMS-pet1的ORF 522[19]，萝卜CMS-Ogu的ORF 138[20]，新型甘蓝型CMS-Hau的ORF 288[21]、水稻CMS-BT的ORF 79相继被发现[22-23]，而水稻CMS-WA的WA352也被证明对大肠杆菌有毒。CMS毒蛋白影响孢子体和配子体线粒体功能，导致雄性不育[18]。大多数CMS蛋白质是10 k～35 kDa的跨膜蛋白，具有一个疏水区，这是典型的细胞毒蛋白特征。CMS-WA的WA 352蛋白对大肠杆菌的毒性依赖于特定的跨膜结构，但在植物中表达WA 352蛋白不含跨膜区域的片段仍然导致雄性不育[23]，表明CMS毒蛋白WA 352诱导植物雄性不育不依赖跨膜结构域。

1.2 细胞质雄性不育的能量缺乏模型

花药的孢子体和配子体细胞需要的生物合成能量比其他器官的细胞能量要多，因此花药细胞可能会通过增加线粒体数目或通过增加线粒体的代谢活性产生更多的能量，线粒体通过mtETC呼吸链传递生产的ATP对花粉发育至关重要。在能量缺乏模型中，线粒体CMS蛋白质会导致线粒体的能量代谢缺陷，而不能满足雄性生殖发育能量需求。在向日葵CMS-PET1中，ORF 522编码含有19个氨基酸蛋白的嵌合基因orfB，该基因产物可能危及F1F0-ATP酶活性[24]，导致CMS-PET1植物的ATP酶活性明显低于可育植株。其它物种的CMS蛋白含有类似orfB序列，包括萝卜ORF 138和ORF 125、白菜的ORF 224和ORF 222、胡萝卜CMS的orfB，都可能通过相似的机制导致雄性不育。另外，CMS蛋白质还可能会影响线粒体膜的完整性，导致质子泄漏和能量产生不足或通过功能性同源竞争mtETC F1F0-ATP酶复合物，形成无效或低效mtETC或F1F0-ATP酶复合物干扰ATP的产生[25]，从而调控育性。

1.3 细胞质雄性不育的异常细胞程序性死亡模型

细胞程序性死亡(PCD)是指生物体在生长发育过程中，由自身基因编码、主动和有序的死亡进程，是生物体新陈代谢过程中正常的生理反应[26]。如果启动PCD程序的基因发生突变，或由于环境因素的改变使PCD程序不能启动或死亡程序执行过程中被提前终止都会使花粉育性发生变化。植物中雄性不育是从小孢子发生到雄配子体发育成熟的不同阶段，小孢子或雄配子体发生了异常的PCD，其中一部分是由绒毡层细胞过早或过晚发生PCD而造成的，还有一部分是在减数分裂过程中特定阶段的PCD异常所引起的。目前，已在拟南芥[27]、水稻[28]、板栗[29]、白菜[30]中发现因相关的程序性死亡而引起的雄性不育现象，并且已在细胞生物学和分子生物学水平上进一步证实是通过细胞程序性死亡过程引起的雄性不育。

2 细胞质雄性不育恢复的机制

如上所述，线粒体不育基因及其产物是导致CMS的主要原因。抑制CMS基因的表达，或抵消其不育产生的负面作用是恢复育性的重要途径，细胞核育性恢复基因(Rf)在该过程中扮演了重要角色。除玉米Rf2编码乙醛脱氢酶外，矮牵牛Rf0[31]，油菜Rf0[32]、水稻Rf1a[33]、Rf1b[34]，萝卜Rfk1[35]及高粱Rf1 和Rf2[36]都编码的是由PPR基序串联组成的PPR蛋白[37]。PPR是高等植物中最大的基因家族之一，在介导植物细胞器基因的表达上起着重要作用，能调节叶绿体和叶绿体基因的表达或RNA的剪接、编辑、加工和翻译等[38]。Rf基因及其产物PPR蛋白可以在不同的分子水平上通过各种机制使育性恢复。关于恢复基因的作用机制：第一是恢复基因编码的产物，弥补了由线粒体基因重排导致的育性相关基因不能正常表达的蛋白产物，使育性恢复；第二是恢复基因抑制了不育基因相关ORF的表达，消除或削弱了不育基因产物毒蛋白的影响。

2.1 恢复基因在转录水平上的作用

恢复基因可以抑制相关CMS基因的转录，从而降低不育基因转录产物，恢复育性。在CMS-S型玉米中，恢复基因Rf3能够减少与不育有关的mRNA转录[39]；在菜豆中，恢复基因Rf2使育性恢复植株中CMS特异转录稳定性下降，基因表达量也下降[40]。萝卜的恢复基因Rf0编码3个高度相似的PPR蛋白(PPR-A、PPR-B、PPR-C)，免疫沉淀显示在体内PPR-B与ORF l38 mRNA相关，直接或间接的作用于ORF 138 mRNA，调控ORF 138 mRNA转录[41]。

恢复基因也能影响CMS相关转录物的加工、编辑，如在甘蓝型油菜恢复基因Rfp影响Pol型不育相关基因转录的加工，使单顺反子atp6转录的丰度增加[42-43]；在高粱A3细胞质中，恢复基因Rf3切割线粒体基因ORF l07 mRNA的核苷酸位点，这种切割是育性恢复的必要条件[44]；实验也证实烟草atp 9基因的编辑和育性恢复相关[45]；另外在CMS-Ogura萝卜中也发现，恢复基因Rft能够对ORF138转录产物进行加工，并调控育性[46]。在CMS-WA水稻中发现，与可育系相比，不育系线粒体基因组中的orfB转录物未被编辑[47]。CMS-HL水稻中的恢复基因Rf5所编码的蛋白是育性恢复复合体的组成成分，该复合体在体外能够切割CMS相关转录物[48]。

2.2 恢复基因在蛋白水平上的作用

恢复基因也可能通过减少不育基因编码的蛋白质积累量而恢复育性[49]。在CMS-C型向日葵中，育性被Rf基因恢复的杂种与不育系转录模式相同，Rf基因不影响不育基因RNA的编辑，但育性恢复的杂种花药中，不育基因编码的16 kDa蛋白产物显著减少[50]；CMS-Ogura型油菜的恢复基因恢复育性的杂种转录没有明显变化，但不育基因蛋白质的丰富度却大大降低[51]；在矮牵牛中发现育性恢复植株与不育植株的线粒体不育基因ORF 138的转录效率相同，但恢复基因编码产物可能降低了ORF 138编码蛋白的稳定性，从而使ORF 138蛋白积累减少[52]；在CMS-Ogura萝卜中也发现，Rf0并不改变ORF l38转录丰度，但是显著降低叶片和花器官中ORF 138蛋白的含量[53]。

3 存在问题及展望

许多物种CMS不育基因和相应的Rf基因被鉴定，加深了人们对核质互作的雄性不育的细胞核/细胞质遗传调控机制的认识，水稻CMS-WA、甜菜CMSOwen和胡椒CMS-Peterson等作物的不育系已成功运用于杂交育种和生产实践。然而，CMS/Rf在一些农作物如烟草、小麦、高粱等上的研究却一直停滞不前，另外，在胞质雄性不育系统中，CMS蛋白和Rf蛋白相互作用和线粒体逆行调节信号尚未确定，CMS蛋白特异性积累并诱导雄性不育的机制仍不清楚。虽然分子生物学技术和理论的迅速发展对CMS的研究起到了巨大的促进作用，但CMS过程涉及花发、配子体发育过程中能量的调配，基因在时间和空间上的相互作用，由于受到许多方面因素的影响，该领域的研究一直都是模糊不清的。鉴于不育系在作物遗传育种中的重要性，需要研究更多的农作物CMS系统并将其应用于农业，以避免遗传脆弱性，笔者认为在今后一段时间内CMS的生物学研究和应用将集中在以下几个方面。

（1）伴随新的研究技术发展，通过全基因组测序技术加大植物基因组研究的范围，鉴定更多作物育性恢复系中的Rf基因；如在水稻和萝卜中[54-56]，测定CMS系的完整线粒体基因组序列测序，提供了寻找新的不育候选ORF的有效途径，增加了对CMS/Rf系统的认识，更助于解决目前在研究CMS/Rf系统方面的挑战。

（2）在机制研究上，需要更详细地了解线粒体ORF编码的蛋白质对花粉育性影响的具体机制，以便揭示更多植物细胞质雄性不育与不育的现状，阐明CMS/Rf的相互作用即两者基因间相应的转录产物和翻译产物的相互作用。从目前已克隆的植物CMS的Rf基因中，多数都含有PPR基序，因此一种更加方便可行的方法就是通过对基因组PPR基序的筛选来克隆植物CMS的rf基因。

（3）在雄性不育系应用方面，雄性不育系对杂种优势明显，在更多的植物中构建雄性不育系的植株对农作物等有巨大作用。通过利用基因工程的方法来创造不同植物种的雄性不育系，从而避免了大多数雄性不育系是通过人工杂交筛选获得、费时费力的缺点，也避免了利用原生质体融合、转基因等生物技术创造雄性不育系实际应用中占的比例很小的局限。随着对CMS育性恢复机制研究深入，已经证明线粒体基因组中的开放阅读框是造成不育的重要原因，但是利用这些开放阅读框的特异性表达影响育性的研究还需更加深刻，因此，线粒体开放阅读框在不育系构建上的应用也是将来需要研究的一个重要方面。此外，利用叶绿体表达载体转化毒素基因构建不育系[57]的研究成功为今后对CMS的研究和应用开辟了新的思路。

（4）可以借助高通量测序技术，综合各种组学研究，从全基因组、转录组、蛋白组、代谢组、表观基因组、表形组等多个水平对植物CMS的分子机制进行全面深入的研究，为挖掘CMS候选基因以及深入解释CMS的分子机制提供丰富的信息，加速对植物细胞质雄性不育和育性恢复调控机制的研究进程。