锂对造血干细胞和神经干细胞作用影响的研究进展

罗宁 钟德君

锂元素被引入现代精神病治疗始于1949 年，当时澳大利亚精神病学家John Cade 描述了这种离子在躁狂患者中的治疗效果[1]。在过去的65 年里，锂在精神病学和其他领域上的应用，及其抗病毒，免疫调节和神经保护作用，已经被证实。早在Cade 论文发表的第2 年，Radomski 等[2]就注意到使用锂离子治疗的患者存在白细胞数量增加的情况，显示出这种离子对造血系统有影响。20世纪70 年代和80 年代，出现了一批报道锂对造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和造血生长因子促进作用的相关研究。近年来，随着干细胞的应用和发展，锂作用于神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的影响也已得到证实。本文系统回顾了国内外关于锂对HSCs 和NSCs 影响的相关研究，详细阐述了锂对干细胞作用的分子机制，并对现阶段锂在临床上的应用和产生的问题进行了综述。

干细胞具有独特的自我更新和分化能力，可在中胚层、外胚层和内胚层分化为祖细胞和组织定向干细胞[3]。干细胞分化发育的谱系包含全能、多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）和单个发育谱系（单能）干细胞。其中PSCs 包括HSCs、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和NSCs[4-6]。

一、锂对HSCs 和NSCs 的作用

（一）锂对HSCs 和生长因子的影响

自1950 年发表了第1 篇关于锂诱导双相障碍患者白细胞增多的论文以来，这一作用被长期报道[7-9]。早期关于锂对造血功能影响的结论来自于一些涉及锂诱导的研究，这些研究中观察到在锂离子的干预下不同种类血细胞出现不同程度数量的增加或减少。锂可诱导骨髓粒细胞生成，影响HSCs。锂通过刺激PSCs 增殖直接影响HSCs，并通过增加粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和其他生长因子的产量间接影响HSCs。Hammond等[10]证明给予周期性中性粒细胞减少症的狗服用锂可消除中性粒细胞、血小板、网状细胞和单核细胞的异常减少。Levitt 等[11]发现锂主要刺激PSCs 和粒单核祖细胞。

在20世纪80 年代，锂对PSCs 和骨髓红细胞及巨核祖细胞的影响也被观察到。在动物模型中，各种集落形成单位、骨髓细胞和外周血白细胞的增加是非常显著的[12]。Joyce[13]在动物模型中发现，锂离子可以增加集落刺激活性，同时还能增加中性粒细胞和血小板的数量。在这些影响之前，骨髓中性粒细胞的产生以及粒-单核细胞、巨核细胞和红细胞等祖细胞集落形成单位的浓度升高。Ballin 等[14]研究了接受锂治疗的8 例成人双相情感障碍（bipolar disorder，BD）患者的CD34+HSCs 数量。3～4 周后，CD34+细胞和中性粒细胞的数量均达到峰值，平均高达88%。此外，中性粒细胞的增加与CD34+细胞的数量也有相关性。Huang 等[15]在研究中发现，含锂的糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）抑制剂在植入人体过程中改善了HSCs 的归巢过程、形成菌落的能力和自我更新能力。Walasek 等[16]已经证明锂和丙戊酸的结合对造血祖细胞和HSCs 的影响最大，其效果超过单用两种化合物中的任意一种。他观察到这一协同作用可增强造血系统自我更新过程，抑制HSCs 的分化，缩短血小板和红细胞的更新周期，并影响了360 个相关基因的表达。

在造血系统中，锂的第二个重要作用是刺激造血相关生长因子的生成。在健康人体内，给予锂离子可在健康人体内增加G-CSF 的释放并在体外实验中促进骨髓中性粒细胞的产生[17]。还有研究观察运用锂离子的大鼠尿中G-CSF 水平升高[18]，外周血单核细胞在锂的作用下促进了G-CSF 的产生[19]。Gamba-Vitalo 等[20]通过影响巨核细胞集落刺激因子间接影响巨核细胞生成。研究发现在锂的作用下，巨核细胞集落刺激因子对生长因子刺激的敏感性增强，其表达浓度增加了200%。

笔者强调虽然锂可能是临床上治疗血液系统疾病的一种潜在药物，但由于目前研究还处于动物实验阶段，需要更多的研究评估临床安全性以及可能出现的其他副作用。在锂真正作用于临床治疗人类血液疾病之前，尚需要解决剂量，给药时间，给药途径，服药周期以及不良反应等问题。

（二）锂对NSCs 的影响

锂对神经系统发生发育的影响已在许多研究中已得到证实。1987 年，Yoshino 等[21]发现施旺氏细胞在加入锂离子后有丝分裂活性增强。Kim 等[22]在涉及锂诱导的体外和体内实验中发现，标记有神经元核蛋白NeuN 的成熟神经元细胞数量增加，表明锂干预后NSCs 的分化作用增强。Son等[23]在完成28 d 锂离子长期治疗方案12 h 和28 d 后，通过注射溴代去氧尿嘧啶（bromodeoxyuridine，BrdU）发现大鼠齿状回中BrdU 阳性细胞数量分别增加了54%和40%。Chen 等[24]和Li 等[25]描述了被BrdU 标记的海马组织中NSCs 在接受锂离子干预后增殖增强。在第一项研究[24]中，锂离子给药导致海马齿状回中BrdU 标记细胞数量增加25%，大约三分之二的BrdU 阳性细胞同时被神经标记物NeuN 标记。第二项研究认为，慢性锂离子治疗也会增加非神经元细胞的数量，包括NSCs 和神经胶质细胞[25]。

在另一个缺血性脑卒中动物模型中，于研究的第7 周服用锂，观察到在脑卒中后7 d 内神经组织损失减少69%[25]。此研究认为，锂可以通过增强NSCs 的增殖和存活，抑制炎症过程，从而提供对中风的长期神经保护。Kang 等[26]研究显示，经锂干预诱导可通过减少脑肿胀和萎缩，减少神经细胞的死亡，最终起到减少大鼠脑出血损伤的作用。Huo 等[27]评估了经锂元素辐射下小鼠海马细胞存活和分化的情况。在锂照射6 h 后，BrdU 标记的细胞数量增加了24%，在第7周增加了59%，显示这一作用为长期效应。此外锂还能降低海马颗粒层干细胞的凋亡。值得注意的是，Oleary 等[28]发现，只有在应激条件下，慢性锂离子治疗才会增加腹侧海马的NSCs 增殖，而这一过程与新生细胞存活率降低有关。

近期Kara 等[29]研究了锂对成年小鼠齿状回亚颗粒区神经发生的影响。他们研究了干细胞发育的不同阶段（Ⅰ型、Ⅱa 型、Ⅱb 型和Ⅲ型），检测了特定的标志物，如巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、双叶皮质蛋白和NeuN。他们发现，锂离子治疗可以增加早期发育阶段（Ⅰ型）的细胞增殖，不影响成神经细胞（Ⅱb 型），也不影响未成熟神经元的数量（Ⅲ型），并减少形态成熟的过程。笔者总结，锂离子通过促进NSCs 的循环来靶向干预干细胞发育的初始阶段。然而，这些过程并没有导致新生神经元数量的增加。锂的作用类似于电休克疗法，靶向于Ⅰ型细胞[30]，但不同于抗抑郁药物靶向Ⅱa 型细胞[31]。

Hill 等[32]评价了锂和丙戊酸对神经细胞分化相关基因表达的影响。锂没有改变干细胞表达标志物的细胞比例，如八聚体结合转录因子、阶段特异性胚胎抗原4、神经元、星形胶质细胞（GFAP）或细胞周期阶段，但它使细胞总数增加了1.4 倍。另一方面，丙戊酸导致八聚体结合转录因子、SSEA、neurofiber M、GFAP 等标志物上调，G2/M 细胞周期阶段细胞减少，细胞总数减少。

但要注意的是，NSCs 研究结果的报道可能由于方法的差异、不同标记物的评价、体内和体外研究的不同结果以及不同的锂给药方案得出不同的结论。例如Hasgekar 等[33]证明了锂对动物神经细胞谱系的生长抑制作用，Misiuta 等[34]观察到锂对人类NSCs 和前体细胞谱系的不同影响。

锂对NSCs 和神经发生的促进影响可能与锂的神经保护特性有关。在临床水平上，这可能反映在锂治疗BD 的大脑灰质增加，尤其是额叶、海马和杏仁核位置的灰质增加最为显著。Yucel 等[35]发现BD 患者在常规接受锂离子治疗的8 周和4 年期间，海马体积均有增加。此外，Bearden 等[36]在锂治疗的BD 患者时同样发现，与健康对照组和非药物治疗的患者相比，锂治疗患者的海马体积更大。Lyoo 等[37]在16 周的治疗中发现锂诱导的患者大脑灰质体积增加，而在服用丙戊酸的患者或健康对照组中则没有效果。Hallahan 等[38]分析了321 例BD 患者和442 例健康个体，发现与未服用锂患者或健康对照组相比，服用锂患者的海马和杏仁核体积增加。Selek 等[39]的研究表明，锂盐治疗4 周后双相障碍Ⅰ型患者的左前额叶皮层和左背外侧前额叶皮层增大。最近，Hajek 等[40]在研究中发现，与长期服用其他不依赖锂元素的稳定情绪药物患者相比，服用锂的BD 患者海马体积增加。

最近的一些临床和实验研究表明，锂在神经退行性疾病治疗中具有非常重要的作用。锂可降低痴呆患病风险[45-46]，预防由阿尔茨海默病引起的认知功能丧失[47]。这可能是由于GSK-3 的抑制，GSK-3 是一种与淀粉样前体蛋白加工和Tau 蛋白磷酸化相关的关键酶。在阿尔茨海默病的动物模型中，Sofola-Adesakin 等[48]描述了锂通过降低蛋白合成和淀粉样蛋白b42水平来抑制淀粉样蛋白病理。Senatorov等[49]通过刺激NSCs 和星形胶质细胞的增殖，在亨廷顿病动物模型中揭示了锂具有神经保护作用。

最近，Dong 等[50]研究了锂对大鼠脊髓前角内及体外MSCs 增殖和神经分化的潜在促进作用。他们证明了锂离子具有促进MSCs 增殖的能力，并通过增加BrdU 的标记得到验证。将骨髓MSCs 移植入大鼠脊髓后，锂离子治疗可提高细胞存活率和神经分化能力。他们的结论是锂可能是一种潜在的药物，可以提高MSCs 移植治疗中枢神经系统疾病的疗效。

笔者认为虽然目前国内外大量的研究提示锂可促进NSCs 的存活、分化、成熟和迁移，且已经有研究尝试将锂作用结合于神经退行性疾病的治疗中。但其具体的安全性评估，剂量的把控以及给药时间和给药途径的选择还需要更多的实验来论证。不论如何，锂成为治疗或改善神经疾病的潜在药物在不久的未来可能有更巨大的临床价值。

二、锂作用的分子机制

锂离子作用的第一个关键机制来源于其阻断GSK-3 的能力，GSK- 3a 和GSK-3b 两种亚型由不同基因编码，同源性98%。GSK-3 磷酸化许多蛋白质，在大多数情况下，这些蛋白质在磷酸化后失活。锂在2 mmol/ L 浓度下可直接抑制GSK-3，在0.8 mmol/L 浓度下可间接通过蛋白激酶B 增加GSK-3 的磷酸化作用。由于锂对GSK-3 的抑制作用导致中性粒细胞增多症，而这是由于造血基本过程的平衡被打破所引起。GSK-3 活性的降低可消除磷酸化，从而增强转录因子缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的活性。骨髓营养微环境通过HIF-1 间接吸引和保留HSCs，从而刺激基质细胞源性因子-1 及其受体CXC 趋化因子受体4（cxc chemotaxis factor receptor 4，CXCR4）的转录。基质细胞源性因子-1 浓度梯度形成HSCs 向骨髓生态位定向的信号[51]。锂对造血系统的影响是通过GSK-3 和HIF-1 的相互作用发生的，抑制GSK-3 间接增加了基质细胞源性因子-1向缺氧骨髓营养位的梯度，而HSCs 可在缺氧的骨髓营养微环境下分化。骨髓营养微环境活性和归巢作用的增强表现为外周血中性粒细胞增多、嗜中性粒细胞增多和CD34+细胞增多[52]。Huang 等[53]认为GSK-3 可能在小鼠HSCs 的稳态中发挥关键作用。锂通过阻断GSK-3 可能调控这一过程的关键元素，影响Wnt、PI3k /磷酸酶、tensin 同源蛋白缺失（PTEN）/Akt 等多个重要信号通路[54-55]。小鼠移植研究表明，GSK-3 抑制剂的使用可增加HSCs 和造血祖细胞的数量[54,56]。此外，GSK-3的异常（通过抑制剂或基因的敲除变异）将使胚胎干细胞保持多能性[57]，并表达多能标记[58]。

Wnt 信号通路在各种干细胞的自我更新中起中心作用。研究人员发现，GSK-3 基因的敲除可增加HSCs 的数量，类似于锂或其他GSK-3 抑制剂，功能内源性β 连环蛋白（β-catenin）在这一过程中是必要的。另一方面，对干细胞功能的纵向研究显示，缺乏GSK-3 的HSCs 数量逐渐减少，说明GSK-3 有维持HSCs 自我更新能力方面的作用。Huang等[53]认为GSK-3 在HSCs 的增殖分化中具有双重作用，保证HSCs 自我更新和分化的平衡。阻断GSK-3 激活mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）和Wnt 两种不同的信号通路，将产生相反的效应。阻断GSK-3，涉及pi3k、PTEN 和Tsc，激活mTOR 通路，可促进分化过程。另一方面，通过Wnt/β-catenin通路抑制GSK-3，导致参与干细胞增殖和自我更新的基因活化。Wnt/b 信号在MSCs 活性中起中心作用，而抑制GSK-3则通过稳定β-catenin 导致通路激活。锂诱导对Wnt 信号的影响，以及软骨形成过程中细胞反应性增强之间存在潜在的重要联系[59]。此外，Wnt/β-catenin 信号通路在骨形成MSCs分化过程中发挥重要作用。

除了以上两种信号通路外，锂离子增强突触可塑性、促进神经细胞存活和抑制神经细胞凋亡的机制还涉及脑源性神经营养因子、GSK-3、环腺苷磷酸酶（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、cAMP 反应元件结合蛋白、磷脂酰肌苷（phosphatidylinosinosine，PI）级联反应、蛋白激酶C 和B 细胞淋巴瘤2[41]。所有这些因素都与维持NSCs 的活性相关。在锂离子治疗的BD 患者中，左侧杏仁核体积与血清脑源性神经营养因子水平、右侧额叶灰质体积增加与GSK-3b基因型之间存在相关性[42-43]。Allaqui 等[44]从人类神经母细胞瘤中提取的SH- SY5Y 细胞，并在0.5 mmol/L 锂的存在下培养了25 周，结果发现这些细胞的生长速度更高，且脂质含量更低。

锂对造血的重要作用可能是通过肌醇单磷酸酶（inositol monophosphatase，IMP)，间接调控肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）的信号通路。然而，Wexler 等[60]发现，在海马中NSCs 的增殖刺激与IMP 无关，但依赖于Wnt 和GSK-3 信号通路。GSK-3 抑制剂咳模拟锂对HSCs 和干细胞的作用，GSK-3a 和GSK-3b 活性的降低也会影响髓系分化的细胞[56,61-62]。锂通过β-catenin 依赖途径诱导HSCs 数量的增加可能通过mTOR 途径的激活和分化的增加得到补偿，这反映在成熟血细胞数量的增加，尤其是髓系血细胞数量的增加上。在后来的研究中，Huang 等[15]已经证明，对HSCs 的长期生存最有利的因素是锂的使用以及mTOR 通路的抑制剂。

锂对粒细胞和巨核细胞的调节也可能与阳离子在细胞膜上的转运相关[63]。在钠的存在下可以观察到这些过程的强化，但在钾离子或钙离子不存在的情况下则观察不到。哇巴因是Na-K ATP 酶的抑制剂，它的存在导致了对干细胞电位不可逆的竞争性抑制。钠转运抑制剂降低了锂增加粒-单核细胞集落形成单位的能力。钙的主动转运对锂诱导的造血作用也有抑制作用。Yoshin 等[21]在体外研究中发现，在钙通道阻滞剂硝苯地平或锰离子（Mn2+）存在的情况下，锂的加入可增加施旺氏细胞的有丝分裂活性。

锂还通过调节免疫系统从而影响造血系统的活性，包括调节某些白细胞介素的浓度和活性变化[64]。Kleinerman等[65]报道，锂作用导致粒细胞增多的机制之一可能是单核细胞增强TNF-a 的产生及其分泌。Gallicchio 等[66]报道通过降低前列腺素对粒子-单核细胞集落形成单位的抑制作用，锂可以增加GM-CSF 的产生。尽管存在针对CSF-1 的抗体，Doukas 等[67]观察到锂对粒细胞祖细胞的刺激作用，这提示了锂作用的另一间接机制。

笔者认为锂对HSCs 和NSCs 的影响涉及多条信号通路的表达以及相应基因和表达产物的影响，但其中最重要的信号通路是GSK-3 和Wnt/β-catenin 通路这一结论已经被大量研究所证实。另外包括调节cAMP、蛋白激酶B、PI3k和IMP 的水平等也与锂作用有紧密的联系。虽然目前已经有大量研究分析锂作用分子机制的报道，并在不同程度上取得了一定进展，但涉及关键信号通路如GSK-3 和Wnt/β-catenin 的重要控制靶点还需要更深入的研究进一步论证。

三、现阶段锂的临床应用

（一）锂在BD 及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的临床应用

近年来，BD 患者的iPSCs 被用于研究BD 的发病机制和锂离子作用机制。Chen 等[68]首次研究了来自BD 患者的细胞系，他们从3 例BD 患者和3 例对照组中获得真皮成纤维细胞，用逆转录病毒构建转导至iPSCs，并进行了8 周的神经分化。他们发现BD 患者源性神经元的特点是膜结合受体和离子通道表达的增加，特别是参与钙信号，以及相关基因的表达和氨基丁酸高尔基复合体的分化，与对照组的神经元明显不同。与对照组相比，锂预处理(在测试前24 h 使用1 mmol/L 的LiCl）改变了BD 神经元的信号通路，降低了钙离子的电位瞬态和振幅。作者认为，锂的这种效应可能是由于诱导Wnt 通路。

在Wang 等[69]发表的另一篇报道中，利用基于纳米结构光子晶体生物传感器的非标记实时光学成像技术，从12 例BD 患者的成纤维细胞中重新编程了诱导的神经元样细胞的细胞黏附表型。他们发现，峰值波长值（peak wavelength value，PWV）的变化（PWV 是细胞黏附度的一种测量方法）与患者内在的锂反应有关。与来自锂无应答者的细胞相比，锂无应答者的细胞黏附性较差。6 例对照组的细胞在黏附测量中处于中间位。作者认为，通过PWV 信号检测，参与细胞黏附特性的关键分子机制与CAM 正和蛋白相互作用有关。

Madison 等[70]的研究应用了一种基于家庭关系的模式，涉及从2 个患有BD 的兄弟及其健康父母的成纤维细胞中提取的iPSCs 系。iPSCs 直接分化为神经谱系，揭示了与神经发生和神经可塑性相关的几种神经发育表型和基因表达的特异性缺陷，包括Wnt 通路和离子通道亚基。作者观察到，通过CXCR4 的表达，BD 患者产生的外周神经系统祖细胞多于中枢神经系统（CNS）祖细胞。随后，GSK-3 抑制剂（CHIR- 99021）治疗挽救了CXCR4+神经祖细胞增殖缺陷，增加了β-catenin 靶基因的表达，激活了Wnt 通路。

Viswanath 等[71]通过对85 篇关于细胞模型应用的文献进行系统的综述研究BD 的病理生理过程，设计细胞模型包括淋巴母细胞样细胞系、成纤维细胞、嗅觉神经元上皮细胞和由iPSCs 重编程的神经元。他发现，最常出现的异常是钙信号传导紊乱、内质网应激反应、线粒体氧化途径、膜离子通道、昼夜节律系统和凋亡相关基因。细胞应激源（如氧化应激）加重了这些异常，体外锂离子治疗往往可以逆转这些异常。

（二）锂在临床应用中运用遇到的问题

Oruch 等[72]回顾了医用锂盐的临床经验和相关问题，他指出医用锂盐目前多为碳酸锂的口服片剂，锂盐经口服后很快入吸收血，以原型从尿中排出，经规律口服5～7 d后血中的锂浓度达稳定状态，在血中的有效血药浓度为 0.5～1.0 mmol/L。因此对于使用利尿剂，存在脱水，或有低钠血症的患者而言等，可能会导致锂盐的过度吸收而发生急性锂中毒。另外如果患者长期大剂量服用锂盐也会产生一定的毒副作用[73]。具体包括对神经系统表现为意识障碍、癫痫发作等；对内分泌系统表现为继发性甲状腺肿大及甲状腺功能减退等；听力表现为听力下降、眩晕和耳鸣等；肾脏损害表现为肾功能损害甚至可能引发尿崩症，其他的副作用包括怀孕妇女服用导致胎儿畸形及男性性功能障碍等也见有文献报道。

笔者认为虽然急性锂中毒所引起的症状非常严重，但实际临床上由于较重视此类情况因而并不常见。而相对于急性中毒，慢性锂中毒更为常见，且引起的症状较为隐匿，且由于目前应用于临床治疗BD 的锂盐治疗剂量和中毒剂量窗口相对接近，因此长期服用锂盐的患者应定期监测血清中锂的浓度，预防慢性锂中毒的发生。

四、展望

锂已经在现代精神病学中使用超过65 年，锂是治疗BD 的唯一药物，其构成了这一疾病长期治疗的基础[74]。在随后的研究中，锂的许多生物学特性包括它抗病毒、血液系统和神经系统保护作用被逐渐发现，锂在干细胞研究中的应用也被越来越多的学者所重视。20世纪70 年代和80年代，人们开始研究锂对HSCs 的影响，近年来对NSCs 和MSCs 的研究对其进行了进一步的补充。经过了40 余年的论证，锂作用的分子机制被不断揭露，到目前为止以上获得的结果为这种离子的作用机制以及BD 的发病机制提供了线索。随着越来越多运用锂治疗相关临床疾病的动物实验的开展，相信未来的发现将有助于锂干预的干细胞在多种疾病治疗中的应用和潜在临床价值。