鸭圆环病毒病原学特性及分子生物学诊断方法研究进展

李天芝 ，于新友 ，张颖

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

鸭 圆 环 病 毒 病 （Duck circovirus disease，DuCVD）是由鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）感染引起的一种免疫抑制性疾病[1]。各品种和日龄鸭均可感染发病，临床表现为羽毛发育不良、脱落、消瘦、贫血、生长缓慢、饲料转化率降低等[2]。单纯感染该病毒时，一般仅造成鸭零星死亡，但该病毒感染后可造成鸭免疫抑制，容易混感或继发其它疾病，致鸭死亡率升高，给养鸭业造成了一定的经济损失。2003年德国学者Hattermann等首先报道该病[3]，随后世界各地均有相关报道，2006年Chen等在我国台湾地区检测到DuCV感染，2008年傅光华等首次在我国大陆地区番鸭中检测到DuCV感染[4]，随后山东、福建、浙江、江苏、广东等省陆续有相关报道。近年来DuCV在我国鸭群中的感染及混合感染病例呈上升趋势[5]，引起兽医界高度关注，具有重要的经济意义。本文综述了DuCV的病原学特性及分子生物学检测方法研究进展作一简要概述，以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

1 病原学特性

DuCV属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子呈圆形或二十面体对称，无囊膜，直径约为15～16nm，是目前已知最小的鸭病毒。病毒对外界环境抵抗力强，鸭群一旦感染后很难清除。目前，尚不能在体外培养。Du CV单链环状DNA病毒，基因组长约 2.0kb，有2个主要的阅读框，ORFV1和ORFC1，分别编码与病毒复制有关的Rep蛋白和核衣壳蛋白Cap蛋白，病毒可分为DuCV-1和DuCV-2两个不同的基因型。

2 分子生物学检测方法

2.1 核酸探针 核酸探针技术是常用的分子生物学诊断技术，它具有操作简单、不受抗原抗体反应的限制、结果易于判定等优点，适合在基层推广使用。Zhang等[6]利用PCR方法扩增出DuCV基因片段约228bp，然后用地高辛标记，建立斑点杂交方法，最小可检测13.2pg DuCV目的基因片段。邹金峰等[7]用地高辛标记DuCV全基因组克隆制成核酸探针，与鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒的cDNA、鸭瘟病毒的DNA和DuCV的DNA进行斑点杂交以检测核酸探针的特异性，结果该探针只与DuCV的DNA杂交呈阳性。敏感性结果表明，该探针对DuCV的最低检出量约为5pg DuCV的DNA。

2.2 常规PCR方法 PCR方法是根据目的片段设计引物，借助仪器和DNA聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段，是一种快速、简便、特异的诊断方法。李志国等[8]根据DuCV Cap蛋白基因序列设计了4条特异性引物，建立了可以同时检测2种基因型DuCV的双重PCR检测方法。结果显示，该方法特异性强，灵敏度高，最低可检测到1拷贝的DuCV核酸。使用建立的双重PCR方法对收集的山东省6个鸭群150只病死雏鸭的组织DNA进行检测，结果显示有50.0%(3/6)的鸭群检出DuCV-1和 DuCV-2的混合感染，33.33%(2/6)的鸭群检出DuCV-2的单独感染。

2.3 套式PCR方法 套式PCR，又称巢式PCR。使用两对PCR引物扩增完整的片段，以第一对引物的扩增产物为模板进行第二轮扩增反应，检测的特异性更好，敏感性也更高。柴顺秀等[9]根据GenBank登录的DuCV保守区基因组序列，设计合成内、外2对引物，通过PCR反应条件的优化，建立了检测DuCV的巢式PCR检测方法。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性，第1轮扩增的灵敏度为10pg，第2轮扩增的灵敏度为0.1pg，通过巢式PCR，敏感性提高了100倍。蔡锐等[10]根据GenBank发布的DuCV序列，运用Primer Premier 5.0设计2对引物，建立了适合DuCV快速检测的套式PCR方法，采用该方法对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行DuCV检测。结果显示，套式PCR对所有内脏病料均能扩增出340bp的条带，而正常鸭胚、健康鸭肝脏、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌的扩增结果均为阴性，该方法第1次扩增的敏感性是1ng，第2次扩增的敏感性是1fg，第2次比第1次扩增的敏感性高106倍。

2.4 多重PCR方法 多重PCR是一种特殊的PCR技术，它在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或2种以上的病毒DNA，它具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。许宗丽等[11]为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒和DuCV的方法，根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物，预特异扩增DuNDV片段大小为823bp，DPV为576bp和DuCV为338bp。经过反应条件的优化，建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法。该方法特异性好，对鸭的其他病原检测结果为阴性，敏感性高，DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μl。 张艳芳等[12]针对 Gen Bank中坦布苏病毒E基因和DuCV REP基因的保守序列，设计合成了2对引物，通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价，建立了鸭坦布苏病毒和DuCV的二重RT-PCR方法。结果表明：该方法对鸭坦布苏病毒和DuCV的检测敏感性达到100fg，使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。曹慧慧等[13]为建立能同时检测并区分DuCV和鹅圆环病毒(Goose circovirus，GoCV)的方法，根据DuCV和GoCV基因组的保守区域设计两对特异性引物，预期特异性扩增DuCV和GoCV片段大小分别为192bp、556bp。经过反应条件的优化，建立了DuCV和GoCV的双重PCR检测方法。特异性检验表明该方法无法扩增其他水禽病原，DuCV和GoCV的最低检出限分别为 104拷贝/μl和 105拷贝/μl。

2.5 荧光定量PCR方法 实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。赵光远等[14]根据GenBank中DuCV基因序列，在保守区设计了1对引物，建立了SYBER GreenⅠ荧光定量PCR检测DuCV的方法。结果：该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA。与H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎病毒等不发生交叉反应，且具有良好的重复性。许宗丽等[15]根据鸭副黏病毒(DPMV)和DuCV保守基因序列，设计了2对特异性引物和2条的TaqMan探针，建立了鸭副黏病毒和DuCV的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好，对鸭副黏病毒和DuCV的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数，该方法特异性强，对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。刘玲凤等[16]为实现对DuCV的快速检测，分析比对Gen Bank中登录的DuCV全基因组序列，在其保守区设计并合成一对特异性引物，建立了DuCV实时荧光定量PCR检测方法，重复性和灵敏性检测结果表明重复性良好，检测下限为67.2拷贝/μl，将建立的DuCV实时荧光定量PCR检测方法分别对鸭肝炎病毒(DHV)、大肠杆菌、新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒、小鹅瘟病毒(GPV)核酸或cDNA进行特异性检测，结果表明特异性良好。

2.6 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本学者Notomi等发明的一项恒温核酸扩增技术，具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，特别适合在现场和基层部门应用。赵光远等[17]根据GenBank中 DuCV基因序列，在保守区设计了6条特异性引物，并对反应条件进行优化，建立了一种适用于DuCV的LAMP检测方法。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应，且扩增反应只需在常规水浴锅中进行，1h内即可完成反应，对DuCV模版DNA的最小检测限为10fg，灵敏度是一步法PCR的1000倍。

3 小结

DuCV是一种新发现的病毒，对其研究还不太深入，目前尚不能进行体外培养。实验室诊断方法主要有电镜观察，分子生物学诊断和间接ELISA方法。电镜法对仪器要求高，一般实验室很难达到，不能广泛应用。间接ELISA方法虽然一次能处理大量样品，但还没有商品化的试剂盒，且鸭群感染后抗体能持续很长时间，因此，检测抗体抗性并不能说明鸭处于发病期。分子生物学检测针对病原检测，发病期鸭组织器官中含大量病毒，且能排毒，在临床检测中具有重要的意义，检测时一定要选取正确的靶器官，常选取发病初期鸭法氏囊、脾脏、肝脏等组织，病健交界部位，样品应新鲜，尽快送实验室检测，全程保持低温，避免样品腐败变质。分子生物检测法种类繁多，各有利弊，探针法虽能检测大量样品，但操作繁琐；常规PCR大多数实验室都能开展，但检测敏感度低，不能定量；荧光PCR操作简便，对仪器和人员要求高；LAMP方法检测速度快，适合基层用，但前期研发困难，检测容易出现假阳性，不同实验室可根据自身的条件进行选择适合的方法。随着分子生物学的发展，不久的将来，一批新型便携式仪器将被研发出现，从而出现一些敏感性更高、特异性好、价廉，可操作性强、适合广泛推广应用的新方法、新技术，为DuCVD的防控工作奠定基础。