非洲猪瘟流行现状分析及诊断方法研究进展

祖立闯，李 娇，谢金文，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上以猪高热、食欲废绝、皮肤发绀、内脏实质器官出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病[1-3]。该病病程极短、死亡率极高，已对发病国家的养猪业造成了灾难性的打击[4-5]，2018年7月末，辽宁省沈阳市发生首例非洲猪瘟疫情[6]，非洲猪瘟对我国养猪业的危害与日剧增。本文分析了ASF流行现状，并对我国研究学者在ASF各种诊断技术方面取得的研究进展进行了综述，对加强我国ASF诊断技术的储备以及制定ASF防控措施均具有一定的参考价值。

1 非洲猪瘟流行现状分析

ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，病毒基因组全长170～190 kb，为有囊膜的双股线状DNA病毒，病毒粒子大小为175～215 nm，呈正二十面体结构[2，5]。该病毒可使各种日龄和品种的家猪与野猪感染并发病，病毒可在多数蜱种中增殖，使蜱成为病毒的贮藏宿主和主要传播媒介[7]。该病毒最早于1921年在非洲东部肯尼亚首次被发现，随后开始在撒哈拉以南的非洲东部、中部、南部等地区蔓延。1957年病毒从非洲的安哥拉传到欧洲的西班牙，病毒开始在欧洲呈零星、持续流行。1971年病毒从西班牙传入南美洲的古巴，南美洲和拉丁美洲的多数国家陆续暴发疫情。2007年病毒传入欧亚接壤的高加索地区，随后开始向俄罗斯南部地区扩散流行，2017年传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克，导致传入我国的风险空前升高。2018年7月末，辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡，病死猪剖检发现脾脏异常肿大，疑似非洲猪瘟病毒感染，经国家外来动物疫病研究中心检测，确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性，通过序列分析发现引起该疫情的非洲猪瘟病毒B646L/p72基因序列与俄罗斯毒株100%匹配，与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒株（Georgia 2007）属于同一进化分支[6]，这是我国发现的首例非洲猪瘟，我国政府通过采取疫点和疫区内所有生猪扑杀措施，疫情得到了有效控制。

2 非洲猪瘟病毒的诊断方法

2.1 PCR方法

PCR方法操作简单、检测快速，是目前最简单的分子生物学检测技术，但该方法的敏感性有限，且扩增后电泳检测需要使用溴化乙锭。吴忆春[8]通过人工合成ASFV VP73基因中保守性较强的基因片段，将其克隆入pET-32a载体，构建重组质粒pETVP73，再根据GenBank中公布的ASFV的VP73基因序列设计特异性引物，以重组质粒为模板，优化PCR扩增条件，建立了检测ASFV的PCR方法，并组装了PCR检测试剂盒。该PCR试剂盒可特异性扩增出429 bp的ASFV VP73基因片段，检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）、健康猪和蜱的基因组均为阴性，试剂盒的敏感性可达0.1 fg，试剂盒批内和批间的重复性检测结果无明显差异，试剂盒分别置于4℃和-20℃条件下保存12个月后稳定性无明显改变。该ASFV PCR检测试剂盒为我国ASFV的快速诊断及流行病学监测提供了重要的技术储备。杨吉飞等[9]建立的ASFV PCR检测方法检测 PPV、PCV2、PRV、口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV、PRRSV、猪水疱病病毒（SVDV）、副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌、猪衣原体、健康猪、蜱均为阴性，能够检测到0.2 fg的重组质粒核酸，检测西班牙食品与农业技术研究院动物健康研究中心和欧盟非洲猪瘟参考实验室馈赠的17个ASFV毒株均为阳性，检测国内收集的50份猪和30份蜱的野外样品基因组均为阴性。该PCR检测方法具有很好的应用性，可以有效地应用于ASF的诊断以及防控。

2.2 纳米PCR方法

纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，将固体纳米金属颗粒悬浮在液体里形成纳米流体，由于纳米流体热导性强，使PCR体系能够更快地达到目标温度，减少在非目标温度的停留时间，在提高PCR反应特异性的同时增加了特异性扩增产物的产量，使纳米PCR检测的敏感性大幅提高，但纳米PCR方法扩增后仍然需要使用溴化乙锭进行电泳检测。崔尚金等[10]采用纳米金颗粒作为热导介子，建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法，该方法检测大肠杆菌、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、猪捷申病毒（PTV）、猪脑心肌炎病毒（EMSV）均为阴性，敏感性是常规PCR检测方法的1 000倍，其最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝，该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测，结果均为阴性，表明以上3个地区均未发现ASFV感染情况，纳米PCR检测方法为ASFV的诊断提供了新技术。

2.3 荧光定量PCR方法

实时荧光定量PCR方法是将光谱技术引入到PCR反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规PCR方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。李洪利等[11]根据GenBank中23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列，设计引物和探针，优化退火温度、Mg2+浓度、引物和探针浓度，建立了检测ASFV的实时荧光定量PCR方法，该方法重复性试验变异系数小于1.3%，敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL 的质粒，检测 CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV等5种猪病病毒均为阴性，表明实时荧光定量PCR方法是一种能够快速、灵敏、特异地检测ASFV的方法。王建华等[12]根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了检测ASFV的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR方法，该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应，不与 PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪流感病毒（SIV）发生交叉反应，该方法最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子，该方法4次重复性检测的变异系数均小于2.0%，应用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测，结果均为阴性。荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强，将逐步成为ASFV的临床诊断、检疫、食品安全检验的重要方法。

2.4 等温扩增方法

等温扩增方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要PCR中的变性、退火步骤即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于60 min，而常规PCR方法的反应时间一般需要2 h以上，且使反应能够在恒温条件下进行，对仪器设备要求低，不需要昂贵的仪器设备，一台水浴锅即可完成扩增反应。等温扩增方法非常适合于ASFV的现场快速诊断，但等温扩增方法的灵敏度较高，易导致假阳性的扩增结果。目前，ASFV的等温扩增技术主要有环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶等温扩增（RPA）两种。王华等[13]通过对ASFV p72蛋白基因序列进行分析，根据p72保守区序列设计合成了内、外2对引物，通过对反应条件进行优化，建立了检测ASFV的LAMP方法，该方法在62℃保温60 min即可完成，最低可检测到1×101拷贝/μL的病毒DNA，比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对ASFV、PCV2、PPV、PRV基因组DNA同时检测，结果仅有ASFV出现条带，而其他均未出现目的条带。表明ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性、敏感性和临床适用性。王建昌等[14]基于ASFV p72基因保守序列，设计并合成引物，建立了检测ASFV的RPA方法，该方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min即可实现对目的片段的有效扩增，仅特异性扩增 ASFV p72基因，对 FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2均没有扩增，对p72重组质粒检测的限达到102拷贝。RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠，为ASF的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

2.5 ELISA方法

ELISA方法高通量、检测快速、操作简单，是目前常用的免疫学诊断技术，可用于猪群中ASFV感染的大规模调查，但作为血清学检测技术，该方法具有一定的滞后性，无法对ASFV的早期感染做出诊断。梁云浩等[15]利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出ASFV P54蛋白，经SDS-PAGE分析显示重组蛋白的大小约为25 ku，Western-blot试验证实重组蛋白具有良好的抗原性，以P54重组蛋白作为检测抗原包被酶标板，通过优化各反应条件，建立了检测ASFV血清抗体的间接ELISA方法，该方法检测CSFV、PRRSV、FMDV、SIV、PRV、猪肺疫、猪丹毒阳性血清均为阴性，检测灵敏度可达1∶320，批内、批间变异系数均小于10%，具有敏感性高、重复性好、特异性强、准确性高等特点。靳雯雯等[16]利用原核系统表达的VP73蛋白作为包被抗原，建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法，该方法对ASFV阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560，检测猪传染性胸膜肺炎、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV 阳性血清均为阴性，批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%，包被好的酶标板37℃放置5 d后检测的敏感性无明显变化，相对于进口ELISA试剂盒的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%，符合率为98.0%，具有良好的特异性、敏感性、重复性、稳定性，可以满足临床ASF抗体检测的需求。

2.6 胶体金试纸检测方法

胶体金试纸检测方法是以胶体金作为示踪标志物，利用层析技术实现抗原抗体特异性检测的一种新型的免疫检测技术。该方法具有快速、灵敏、特异等优点，尤其适合临床的快速诊断，但该方法的敏感性较高，易出现假阳性。张鑫宇等[17]利用原核表达系统表达了ASFV p54重组蛋白，利用His亲和层析成功纯化了p54蛋白，将纯化蛋白利用胶体金标记后喷涂于玻璃纤维垫，分别以葡萄球菌A蛋白（SPA）和抗p54多克隆抗体作为检测线和质控线，制备了检测ASFV p54抗体的胶体金免疫层析试纸，该试纸条的敏感性为200 ng/mL，检测 CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV2 阳性血清均为阴性，采用该胶体金试纸条和ELISA方法检测24份ASFV弱毒免疫后第13天的猪血清样品（由英国Pirbright研究所OIE ASF参考实验室提供），胶体金试纸条的检出阳性率为100%，而ELISA检出阳性率为33.3%。ASFV抗体免疫层析检测方法具有特异性强、敏感性高等特点，在5～10 min内可以判定结果，适合临床ASF的血清学快速诊断和流行病学调查，在ASF防控中具有良好的应用前景。

3 结语

在我国的《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020）》中，ASF被列为优先防范的13种重大外来动物疫病之一，且我国已发生首例ASF疫情，该病一旦在我国广泛流行，将给我国养猪业及养猪相关产业造成巨大冲击。目前应加强流行病学调查和主动监测排查工作，保持高度警惕，防止该病在我国的进一步流行。本文通过综述我国研究学者在ASF各种诊断技术方面取得的研究进展以及各种诊断方法的优缺点，为开发具有我国自主知识产权的ASFV诊断技术和诊断试剂盒奠定了基础，为我国防控ASFV提供了技术储备。相信随着国家对ASF疫情的不断重视与严防严控力度的不断加强，研究学者对ASF诊断技术研究的不断完善，我国必将能控制和消灭ASFV在我国的流行。