PLK1抑制剂Volasertib靶向治疗肿瘤的研究进展

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(南华大学医学院肿瘤研究所；肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室,湖南 衡阳 421001)

肿瘤分子靶向治疗是在肿瘤分子生物学的基础上，以肿瘤组织或细胞相关的特异性分子作靶点，使用能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等靶标分子特异性抑制剂或药物达到直接治疗或导向治疗目的的一类治疗方法。靶向有丝分裂是肿瘤分子靶向治疗方法的一种。多种靶向有丝分裂的药物已被用于临床，且已被证实在临床上具有明显的抗肿瘤活性，例如传统的微管蛋白结合剂紫杉烷类和长春碱类药物。然而，传统的微管蛋白结合剂抗肿瘤药物因缺乏特异性，均会导致各种不良反应，例如神经毒性等。因此越来越多的研究聚焦于集中开发更具特异性的新型抗肿瘤药物。PLK1(polo-like kinase1)是一种丝/苏氨酸激酶，在有丝分裂过程中起重要调节作用，目前已成为一个备受人们关注的肿瘤治疗靶点。volasertib是目前最具特色的ATP竞争性PLK1小分子抑制剂。不论是单药治疗还是联合治疗，volasertib在多种临床前/临床研究模型中均表现有明显的抗肿瘤作用。本文主要探讨volasertib靶向治疗肿瘤的研究进展。

1 PLK1

PLK1(polo-like kinase1)是首个被发现的Polo激酶，并通过作用于不同的特异性底物来调节几种有丝分裂事件：包括(1)磷酸化激活Cdc25c和CyclinB1/Cdk1复合物促进有丝分裂启动；(2)调节微管成核促进有丝分裂进展；(3)促进中心体成熟以及纺锤体两极分配；(4)调控胞质分裂；(5)调控后期促进复合物APC/C促进有丝分裂退出。与其在有丝分裂中不同的功能相一致，PLK1具有多种定位。间期，PLK1定位在细胞质、微管和中心体上。有丝分裂和胞质分裂期则集中在着丝粒、微管及中心纺锤体上。PLK1还参与DNA复制和染色体/微管动力学过程。此外，PLK1也参与DNA损伤应答反应过程[1]，包括DNA检查点的激活、维持以及损伤恢复。PLK1也已被证实在广泛的恶性肿瘤中过表达，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌和弥漫性大B细胞性淋巴瘤等。同时，PLK1过表达与许多恶性肿瘤(包括NSCLC，结肠癌和肝母细胞瘤)的预后相关，因此推动了PLK1小分子抑制剂的发展。

2 PLK1抑制剂

目前主要有两类PLK1小分子抑制剂。第一类是靶向PLK1 KD(kinase domain)的小分子抑制剂。KD，即PLKs的N端上的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它与底物空间上接邻并催化底物磷酸化，且具有特定的作用靶点—ATP结合域。ATP结合域是蛋白激酶催化区域上的一段高度保守区域。这类PLK1小分子抑制剂的作用机制是结合PLK1上的ATP结合域，从而抑制PLK1的活性。近年来针对PLK1 KD的小分子抑制剂的研究已取得显著成果，多数是ATP竞争性抑制剂，且部分药物已经进入临床研究阶段并显示出抗肿瘤活性。其中具代表性的药物是BI2536与volasertib(BI6727)。BI2536是一种二氢蝶啶酮类化合物，许多临床前研究中表明BI2536具有抗肿瘤活性，然而后续临床研究发现其疗效差，且存在许多严重的不良反应。因此，人们研发了第二代二氢蝶啶酮类的PLK1小分子抑制剂volasertib (BI6727)。Volasertib与BI2536具有相同的有效性和特异性，但较后者它适用安全范围更广，且毒副作用小。因此，volasertib是目前最具特色的ATP竞争性PLK1小分子抑制剂。PLK1 KD小分子抑制剂中还有另一种类型：即ATP非竞争性抑制剂。这类抑制剂主要结合于PLK1待磷酸化的底物结合位点，具有对PLK1的底物依赖性和ATP非竞争性的特点。此类小分子化合物主要为苄苯乙烯砜类和均二苯乙烯类化合物。其中具有代表性的药物为ON01910。ON01910是一种水溶性的苄苯乙烯砜类似物，在小鼠肿瘤异种移植模型中具有抗肿瘤活性，具体作用机制不清楚，目前处于I期临床研究阶段。最新研究[2]表明ON01910对PLK1的抑制作用很弱，且同时交叉抑制多种激酶。因此对ON01910仍需进一步探索研究。目前靶向PLK1 KD的小分子抑制剂在临床研究的主要问题是剂量限制性毒性作用，这是由于抑制剂的特异性低所导致的。多数PLK1抑制剂可同时交叉抑制其它蛋白激酶，因此研发PLK1特异性的抑制剂成为关键。

第二类是靶向PLK1 PBD(Polo-box domain)的小分子抑制剂。PBD，即PLKs的C端上的特征性结构域，它参与调节PLK1的亚细胞器定位并增强KD对底物的磷酸化作用。PBD上含有1个由多种关键性氨基酸残基组成的袋状结构，此结构可与磷酸肽结合从而介导磷酸化反应，这一过程可被特异性靶向抑制，这表明PBD可成为PLK1的另一靶点。除此之外，PLKs家族是唯一含有PBD特殊结构的激酶，且PLK1-4激酶含有的PBD与各自不同的底物高度特异性结合，这说明PBD可代替KD成为PLK1高度特异性的靶点。这类小分子抑制剂目前有poloxin(PXN)、百里香琨(thymoquinone)、红倍酚( purpurogallin，PPG) 和poloxipan(PXP)。这类抑制剂可通过阻止PLK1与底物结合以及干扰PLK1亚细胞器定位来抑制PLK1活性，从而表现出抗肿瘤活性。有研究发现此类抑制剂仅仅抑制PLK1活性，对PLKs其他成员并无抑制作用。尽管PBD靶向药物特异性强，已成为新型PLK1抑制剂，但此类小分子抑制剂与PBD的结合水平仍较低，因此未来需研发具有高效细胞摄取率和高度稳定性的PLK1 PBD特异抑制剂。

3 Volasertib的分子结构与特点

volasertib是第二代二氢蝶啶酮类的衍生物,是目前最受瞩目的ATP竞争性PLK1小分子抑制剂。它通过两个氢键结合PLK1激酶结构域(ATP)的NH2末端和COOH末端铰链区-ATP口袋，从而导致PLK1激酶失活。volasertib的有效性和特异性和BI2536相同。但较后者，volasertib具有良好的药理学特征，即高分布性和良好的组织渗透性，因此毒性作用小、不良反应少。然而由于细胞内存在大量蛋白激酶，且ATP结合域是一段高度保守序列，导致volasertib与多数ATP竞争性抑制剂相同可同时交叉抑制其它蛋白激酶。此外，相较于其前身BI2536，volasertib改善并提高了药物动力学，延长了与肿瘤接触的时间，提高了生物利用率，并具有高组织分布性和较长半衰期等特点。鲁道夫等[3]发现volasertib在抑制PLK1的同时还可抑制PLK2和PLK3，IC50值分别为0.87 nmol/L、5 nmol/L和56 nmol/L。 PLK2和PLK3有抑制肿瘤生长的作用，因此volasertib对PLK2和PLK3的药理抑制作用可能会使它们在细胞内的抗肿瘤活性降低或丧失。然而多项试验结果表明，当volasertib浓度升至10 μmol/L时，其对50种不同功能的蛋白激酶的活性并无明显的抑制作用。同时,不论是单药治疗还是联合治疗， volasertib在大量临床前研究中都表现对多种人类恶性肿瘤有明显的抗肿瘤活性，这使得PLK1成为治疗多种人类恶性肿瘤的一个热门靶点。最近，食品药品监督管理局(FDA)授予volasertib为抗肿瘤药物的一项重大突破，并批准volasertib可作为PLK1小分子抑制剂抗肿瘤药物在临床上治疗急性髓性白血病(AML)患者[4]。因此，volasertib是目前最具特色且最成功的ATP竞争性PLK1小分子抑制剂。

4 Volasertib的抗肿瘤机制

Volasertib的抗肿瘤分子机制主要是抑制PLK1表达从而发挥抗肿瘤活性的作用。PLK1表达下调可调控多种蛋白水平发生变化。Volasertib可通过抑制PLK1的表达，进一步下调促癌基因(Ras、C-myc和HIF)的表达和上调抑癌基因(p53和PTEN)的表达，导致抑制肿瘤细胞生长增殖、并诱导肿瘤细胞凋亡。其中，PLK1和p53可相互负相调节，且关系最为复杂紧密。一方面，PLK1可直接与p53结合，抑制p53的转录激活和p53的促凋亡作用；另一方面，PLK1可通过磷酸化MDM2和拓扑异构酶I结合蛋白(Topors)以及激活Cdc25C酶，进而间接抑制p53的转录激活，并增强了p53的降解[5]。因此，volasertib可通过抑制PLK1的表达进而上调p53的表达，从而影响下游相关靶基因的表达来抑制肿瘤细胞增殖。Volasertib还可通过抑制PLK1活性来下调β-整合素表达，进而抑制肿瘤细胞侵袭与转移。有研究人员[6]通过软琼脂集落形成试验发现了volasertib能够消除细胞自我更新的能力。Volasertib[7]可通过抑制含溴基结构域的BDR4蛋白的活性，从而下调MYC的表达，进一步抑制肿瘤细胞增殖。Fingas等[8]发现volasertib通过抑制细胞内Mcl-1蛋白表达从而诱导细胞凋亡。Cholewa等[9]发现volasertib可上调肿瘤细胞内异质性核糖核蛋白(hnRNPC)的表达，进而抑制极光激酶B，最终导致肿瘤细胞微核化凋亡。尽管volasertib与细胞内代谢途径之间的联系仍不清楚，但有研究发现volasertib可下调乳酸脱氢酶A、乳酸脱氢酶B(LDH-A和LDH-B)以及磷酸己糖异构酶(GPI)的表达，进而影响肿瘤细胞糖酵解代谢途径。

5 Volasertib的临床前研究

5.1单药治疗Volasertib可抑制多种肿瘤细胞系细胞增殖，包括人结肠癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞和非霍奇金淋巴瘤细胞等，且volasertib对肿瘤细胞的抑制作用随着其药物浓度提升和作用时间延长而增强。研究人员在小鼠结肠癌(HCT116)移植模型上注射单剂量为35 mg/kg的 volasertib后，发现从小鼠的肿瘤组织、多个器官及血浆样品中提取的药物浓度都很高。体内实验显示，不论采用静脉注射或口服的治疗方式，volasertib在人结肠癌和肺癌移植小鼠模型上都表现出很强的抗肿瘤作用和良好的耐受性。免疫组化分析显示：在上述2种肿瘤移植模型中，本品在抑制肿瘤生长的同时，也致使肿瘤细胞有丝分裂指数和凋亡率升高。尽管volasertib在小鼠体内耐受性良好，但Trakala等[10]人发现人体内PLK1过度缺乏会阻止巨核细胞多倍体化，从而导致体内巨核细胞成熟障碍和严重的血小板减少症。这些结果与volasertib在临床试验中产生的不良结果一致。因此为了降低它的临床毒性，故对其作用于细胞周期的机制仍需进一步研究。

5.2联合治疗有体外实验表明volasertib能增强顺铂和甲氨蝶呤抑制人骨肉瘤(HOS)细胞增殖的效应，且volasertib和长春碱、多柔比星之间也具有协同抗癌作用。Weiss等[11]发现volasertib和长春新碱可协同诱导尤文肉瘤(ES)细胞凋亡，两者联合治疗的肿瘤细胞中可检测到Bcl-2高磷酸化、Mcl-1表达水平下调，从而激活促凋亡蛋白BAX和BAK的表达，导致caspase激活和线粒体膜电位丧失，最后诱导细胞凋亡。Hong等[12]发现volasertib和sepantronium (靶向survivin的蛋白)在非小细胞肺癌细胞中有协同抗癌作用。此外，Volasertib联合化疗、放疗和靶向制剂在不同的肿瘤异种移植模型中都已被证实有协同抗癌作用。Volasertib联合阿糖胞苷治疗的抗癌疗效在AML患者皮肤来源的肿瘤细胞小鼠移植模型(AML-6252)上明显增强，且药物毒性作用降低[13]。Abbou等[14]发现在人类横纹肌肉瘤小鼠移植模型中，volasertib和长春新碱联合治疗较单药治疗可显著降低肿瘤体积。此外，在鳞状细胞癌(SCC)移植模型上，volasertib可通过诱导肿瘤细胞阻滞在细胞周期，增强放疗的抗癌作用。因此，volasertib在组合治疗方案中有广阔前景。

5.3药物耐受性Volasertib在紫杉烷类和长春碱类耐药的肿瘤细胞以及表达多重耐药(MDR1)基因的黑素瘤细胞细胞中仍具有抗肿瘤活性。MDR的产生与转运蛋白如ABC-B1、ABC-C1和ABC-G2主动外排药物有关。在转运蛋白过表达的耐药细胞中可观察到volasertib和靶向转运蛋白的抗癌药物具有协同作用，表明volasertib可逆转这些转运蛋白的MDR活性。流式细胞实验结果表明PLK1抑制剂通过抑制转运蛋白的流出，导致靶向转运蛋白的抗癌药物在细胞内累积并发挥作用。有研究发现volasertib通过抑制ATP水解来逆转ABC-B1介导的MDR，且volasertib也可作为ABC-G2转运蛋白的竞争性抑制底物。此外，Bhola等[15]发现PLK1在雌激素受体α阳性(ER +)乳腺癌中起关键作用，volasertib抑制PLK1表达可消除雌激素非依赖性的ER转录活性和降低ER蛋白水平，从而抑制激素非依赖性(ER +)MCF7和HCC1428乳腺癌细胞生长。综上所述，volasertib耐受性比一些传统抗癌药物要好，且具有一定的临床应用价值，从而使它在临床上得到广泛地应用。

6 Volasertib的临床研究

6.1单药治疗在一项剂量递增的I期临床试验中，65名晚期或转移性实体瘤患者每三周1次接受volasertib 12-450 mg的1 h静脉注射，结果，有3名受试者(5%)达到部分缓解(PR)，26名受试者(40%)病情稳定，2名受试者无明显反应，在受试的晚期膀胱上皮癌、卵巢癌和黑色素瘤患者中，有31名(48%)达到PR和病情稳定，并有6人无进展生存期(PFS)超过6个月，其中2人的PFS分别达403和550天；受试者常发生的不良反应包括贫血(22%)、中性粒细胞减少(15%)、血小板减少(14例%)、疲劳(15%)、恶心(9%)和脱发(9%)，不良反应均可逆[16]。在一项II期临床试验中，50名晚期膀胱上皮癌重症患者每三周1次接受volasertib 300mg的1h静脉注射，结果，7名受试者(14%)达到PR，13名受试者(26%)病情稳定，受试者对药物反应时间平均为41周，PFS平均为6.1周，尤其，16名受试者(32%)PFS超过90天，10名受试者(20%)PFS甚至超过180天；受试者常发生的不良反应为中性粒细胞减少(28%)、血小板减少症(20%)和贫血(16%)，不良反应均可逆[8]。

6.2联合治疗在一项I期临床试验中，30名晚期或转移性实体瘤患者每三周1次接受volasertib 100～300 mg和顺铂60～100 mg/m2的1h静脉注射，结果，有2名受试者(6.7%)达到PR，11名受试者(36.7%)病情稳定，受试者PFS平均为93.5天[17]；受试者主要的不良反应是血小板减少、中性粒细胞减少和疲劳。在一项I/IIa期临床试验中，复发性或顽固性急性髓细胞白血病(AML)患者分组接受volasertib(150、250、300和400 mg，每28天的第1天和第15天各一次，1h静脉注射)单用或与低剂量阿糖胞苷(20 mg，每天两次)联用，结果，volasertib单用的低剂量(150和200 mg)组13名受试者4人病情稳定，而高剂量(300和400 mg)组16名受试者有4人达到完全缓解(CR)，5人血象短暂性稳定；单药治疗组29名受试者有8人出现不良反应，包括贫血、血小板减少、鼻出血以及疲劳；联用组32名受试者中有7人达到完全缓解(CR)，2人达到PR，6人血象基本稳定[18]。在一项剂量递增的I期临床试验中，具有晚期实体肿瘤患者分组接受volasertib(150～350 mg，每三周1次，1h静脉注射)和阿法替尼或尼达尼布联用，结果，本品与阿法替尼联用组中两名受试者达到PR，1名为非小细胞肺癌患者，1名为舌鳞状细胞癌患者；本品与尼达尼布联用组中1名乳癌患者达到CR，PFS为447天，1名非小细胞肺癌患者达到PR，PFS为267天[19]。

7 展 望

Volasertib作为目前最具特色的PLK1小分子抑制剂，它的出现对人类恶性肿瘤的治疗是一个重大突破。然而，volasertib在临床应用上仍存在一些血液系统的不良反应，这与volasertib作用于PLKs家族特有结构ATP结合域有关。有研究表明PLK1-PLK4 ATP 结合域的结构体系彼此相似，但又各自含有其特有的氨基酸残基，其中F58和R134为PLK1 ATP结合域所特有，那么是否可以利用PLK1与特异性氨基酸残基的相互作用进而提高volasertib的特异性。还有研究报道[20]纳米载体可增强药物特异性，实现个体的精准治疗，那么是否可以利用纳米载体来运输volasertib进而降低它的不良反应。这些都有待于临床前及临床研究探索解决。尽管如此，volasertib相较于传统抗癌药物，其毒性作用小、不良反应少。许多高龄或无法耐受标准化疗的重症患者可考虑进行PLK1抑制治疗作为替代治疗策略。并且，volasertib已经作为单一或联合抗癌药物被批准上市，主要用于治疗AML患者。因此，volasertib是一种很有潜力的新型抗肿瘤药物，以上对volasertib临床前及临床的研究为治疗人类恶性肿瘤提供了依据。

参考文献：

[1] 骆慧惠, 黄波, 周平坤. 真核翻译起始因子4E结合蛋白1[J]. 中南医学科学杂志, 2015, 43(3):241-4.

[2] BOWLES DW, DIAMOND JR, LAM ET, et al. Phase I study of oral rigosertib (ON 01910.Na), a dual inhibitor of the PI3K and Plk1 pathways, in adult patients with advanced solid malignancies[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(6):1656-65.

[3] RUDOLPH D, STEEGMAIER M, HOFFMANN M, et al. BI 6727, a polo-like kinase inhibitor with improved pharmacokinetic profile and broad antitumor activity[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(9):3094-102.

[4] MUNCH C, DRAGOI D, FREY AV, et al. Therapeutic polo-like kinase 1 inhibition results in mitotic arrest and subsequent cell death of blasts in the bone marrow of AML patients and has similar effects in non-neoplastic cell lines[J]. Leuk Res, 2015, 39(4):462-70.

[5] 钟雅婷, 唐运莲. 肿瘤细胞中p53与PLK1相互关系的研究进展[J]. 医学研究杂志, 2016, 45(2):146-9.

[6] BOGADO RF, PEZUK JA, DE OLIVEIRA HF, et al. BI 6727 and GSK461364 suppress growth and radiosensitize osteosarcoma cells, but show limited cytotoxic effects when combined with conventional treatments[J]. Anticancer Drugs, 2015, 26(1):56-63.

[7] GJERTSEN BT, SCHOFFSKI P. Discovery and development of the polo-like kinase inhibitor volasertib in cancer therapy[J]. Leukemia, 2015, 29(1):11-9.

[8] STADLER WM, VAUGHN DJ, SONPAVDE G, et al. An open-label, single-arm, phase 2 trial of the Polo-like kinase inhibitor volasertib (BI 6727) in patients with locally advanced or metastatic urothelial cancer[J]. Cancer, 2014, 120(7):976-82.

[9] CHOLEWA BD, PELLITTERI-HAHN MC, SCARLETT CO, et al. Large-scale label-free comparative proteomics analysis of polo-like kinase 1 inhibition via the small-molecule inhibitor BI 6727 (Volasertib) in BRAFV600E mutant melanoma cells[J]. J Proteome Res, 2014, 13(11):5041-50.

[10] TRAKALA M, PARTIDA D, SALAZAR-ROA M, et al. Activation of the endomitotic spindle assembly checkpoint and thrombocytopenia in Plk1-deficient mice[J]. Blood, 2015, 126(14):1707-14.

[11] WEISS L M, HUGLE M, ROMERO S, et al. Synergistic induction of apoptosis by a polo-like kinase 1 inhibitor and microtubule-interfering drugs in Ewing sarcoma cells[J]. Int J Cancer, 2016, 138(2):497-506.

[12] HONG M, REN M, SILVA J, et al. Sepantronium is a DNA damaging agent that synergizes with PLK1 inhibitor volasertib[J]. Am J Cancer Res, 2014, 4(2):135-47.

[13] P SOLANS B, FLEURY A, FREIWALD M, et al. Population pharmacokinetics of volasertib administered in patients with acute myeloid leukaemia as a single agent or in combination with cytarabine[J]. Clin Pharmacokinet, 2018, 57(3):379-92.

[14] ABBOU S, LANVERS-KAMINSKY C, DAUDIGEOS-DUBUS E, et al. Polo-like kinase inhibitor volasertib exhibits antitumor activity and synergy with vincristine in pediatric malignancies[J]. Anticancer Res, 2016, 36(2):599-609.

[15] BHOLA NE, JANSEN VM, BAFNA S, et al. Kinome-wide functional screen identifies role of PLK1 in hormone-independent, ER-positive breast cancer[J]. Cancer Res, 2015, 75(2):405-14.

[16] SCHOFFSKI P, AWADA A, DUMEZ H, et al. A phase I, dose-escalation study of the novel polo-like kinase inhibitor volasertib (BI 6727) in patients with advanced solid tumours[J]. Eur J Cancer, 2012, 48(2):179-86.

[17] AWADA A, DUMEZ H, AFTIMOS PG, et al. Phase I trial of volasertib, a polo-like kinase inhibitor, plus platinum agents in solid tumors: safety, pharmacokinetics and activity[J]. Invest New Drugs, 2015, 33(3):611-20.

[18] DOHNER H, LUBBERT M, FIEDLER W, et al. Randomized, phase 2 trial of low-dose cytarabine with or without volasertib in AML patients not suitable for induction therapy[J]. Blood, 2014, 124(9):1426-33.

[19] DE BRAUD F, CASCINU S, SPITALERI G, et al. A phase I, dose-escalation study of volasertib combined with nintedanib in advanced solid tumors[J]. Ann Oncol, 2015, 26(11):2341-6.

[20] 李科, 徐仓宝. 纳米医学在心血管疾病诊疗中的应用研究进展[J]. 中国动脉硬化杂志, 2017, 25(8):757-63.

(本文编辑：蒋湘莲)