免疫磁分离-两重荧光定量PCR法快速检测鲜猪肉中金葡菌和志贺氏菌

□ 杨 旭 山东银宝食品有限公司

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

本实验过程中所使用仪器包括：免疫磁分离系统（由美国Matrix公司提供），PCR荧光定量分析仪（由美国ABI公司提供）；电子天平；离心管；移液枪。

本实验过程中所使用试剂包括：金黄色葡萄球菌多克隆抗体（由美国Matrix公司提供）；志贺氏菌多克隆抗体（由美国Matrix公司提供）；超顺磁性纳米微球（由上海AllMag公司提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫磁分离

将金葡萄球菌、志贺氏菌菌悬液1.0 mL剂量加入装有免疫磁球离心管内，室温状态下结合反应30.0 min，利用免疫磁分离系统进行分离反应30.0 min，洗涤磁球-细菌重复3次，加入1.0 mL剂量1×PBS混悬液，以充分分散离心管内磁球，取洗涤后上层清液以及最终磁球混悬液200.0 μL剂量，涂布后在36.0 ℃下进行培养，维持24.0 h对检测结果进行观察。在此基础之上利用移液枪将经处理后免疫磁球转移至免疫磁分离系统磁球吸附磁铁装置上，称取25.0 g剂量鲜猪肉样本以及225.0 mL剂量NB培养基体系中接种金葡萄球菌、志贺氏菌菌液（菌液均为10倍稀释），制备为250.0 mL待检测体系，将体系放置于免疫磁分离系统上，循环富集反应时间为30.0 min，将经过上述处理后形成2.0 mL剂量金葡萄球菌、志贺氏菌菌体-磁球复合物混悬液作为待分析样本，取200.0 μL剂量涂布后进行技术检测，剩余混悬液进行DNA提取。

1.2.2 核酸提取

在4.0 ℃反应条件下取10 000.0 g待分析样本，离心处理5.0 min后弃上层清液备用，使用金葡萄球菌、志贺氏菌菌基因组相对应DNA提取试剂盒进行DNA提取，对核酸纯度、核酸浓度进行检测，所提取DNA在-20.0 ℃条件下妥善保存。

表1 金葡萄球菌、志贺氏菌免疫磁球检测结果示意表

1.2.3 两重荧光定量PCR检测

将经检验证实金葡萄球菌以及志贺氏菌阴性鲜猪肉样本40份划分为4组，每组内设置1份空白对照样品，其他样品分别接种金葡萄球菌以及志贺氏菌，对两重荧光定量PCR检测法下检测限进行测定与分析。CFUg。各组均可准确检出所添加标准金葡萄球菌、志贺氏菌菌株，对应阴性样品检测结果呈阴性。结果提示，金葡萄球菌、志贺氏菌在免疫磁分离-两重荧光定量PCR法检测下所对应检测限分别为2.52 CFU/g以及1.36 CFU/g。所有样品均用于测定金葡萄球菌、志贺氏菌株，检测灵敏度、特异性以及准确性均为100%。

3 结论

2 实验结果

2.1 免疫磁球特异性检测

表1为金葡萄球菌、志贺氏菌的免疫磁球检测结果示意表。结合表1数据可见，金葡萄球菌、志贺氏菌两种免疫磁球均具有良好特异性。

2.2 检测限

所选择4组新鲜猪肉样本分别接种金葡萄球菌、志贺氏菌，250.0 mL体系中金葡萄球菌终浓度区间为0.25 CFU/g～2 520.0 CFU/g，志贺氏菌终浓 度 区 间 为 0.136 CFU/g～1 360.0

本文通过实验方式利用免疫磁分离-两重荧光定量PCR法对鲜猪肉样本中的金葡萄球菌以及志贺氏菌进行检测，结果显示免疫磁分离-两重荧光定量PCR法能够在6.0 h时间内完成对鲜猪肉样本中金葡萄球菌以及志贺氏菌的检测，具有检测过程快速性、检测结果灵敏度高、特异性高以及准确可靠等诸多优势，可作为食品样本中常见食源性致病菌的常规检测方法之一，加以推广应用。

[1]蔡亦红.PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立[J].中国人兽共患病学报 ,2008(2)：150-153.