贴壁法与悬浮法诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的对比研究

李献帅 陈献国 楼 洋 许 博 徐小义

用体外诱导的心肌细胞重建损伤心肌是目前的研究热点。胚胎干细胞在备选干细胞中，最具发育潜能性和研究价值。目前胚胎干细胞体外分离和培养的实验方法已经很成熟，满足大量培养和扩增的需要，并可定向分化为心肌细胞[1-3]。动物实验表明，胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞移植到体内后仍表现出非凡的扩增能力[4-7]，这意味着干细胞移植修复心肌细胞将成为可能。本文使用人胚胎干细胞，分别通过直接贴壁法和悬浮法诱导分化为心肌细胞，寻找效率、可行性更高的实验方案，为体外胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞更为深入的研究提供基础实验依据。

1 实验方法

1.1 干细胞来源 人胚胎干细胞来自于上海斯丹赛生物技术有限公司X-01干细胞系。

1.2 主要试剂 DMEM/F12（Gibco SH30370.03），1%非必需氨基酸（Gibco），L-谷氨酰胺（Gibco），0.1mM β-巯基乙醇（Gibco），高糖 DMEM（Gibco），青链霉素（Gibco），丝裂霉素 C（Sigma），5%血清替代品SR（Gibco），普通胎牛血清 FBS（Gibco），干细胞专用胎牛血清 ES qualified FBS（Gibco 16141-061），成纤维细胞生长因子（bFGF Gibco HL20676），B27无血清添加剂（Gibco 17504-044），RPMI1640培养基（Gibco 22400089），activin A（Gibco PHC9564），BMP4（Gibco），维生素 C，NaHCO3，PBS（Gibco），0.05%胰酶（Gibco），明胶，基质胶（BD Pharmingen），胶原酶Ⅳ（Gibco），白血病抑制因子 LIF（Gibco）。

1.3 主要仪器 低速控温离心机（Thermo Scientific CL10），高速控温离心机（Thermo Pic017），液氮罐（Thermofisher YDS35HC35），电动移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1），CO2培养箱（Thermo，HERA cell150i），冻存管（NUNC），50mL/15mL 离心管（NUNC），6cm/10cm细胞培养皿（NUNC），6孔板/24孔板细胞培养皿（NUNC），低黏附性培养皿，超净台，显微镜，水浴锅。

2 实验方法

2.1 人胚胎干细胞悬浮法制备EB以及分化 用200U/mL胶原酶Ⅳ370C处理人胚胎干细胞克隆10min后，挑起克隆转移碎片到低黏附性培养皿中悬浮培养以形成拟胚体。4天后将拟胚体转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养（1～3EBs/cm2），如结果中所需的时间分化成跳动的心肌细胞。

2.2 人胚胎干细胞加诱导剂的贴壁法分化 用200U/mL胶原酶Ⅳ370C处理人胚胎干细胞克隆10min后，以1×105个/cm2的细胞密度转移到0.1%明胶处理过的培养皿中。用8ng/mL bFGF的条件培养基（人胚胎干细胞培养基培养MEF细胞24h后的培基）培养6d后，更换为1640-B27培养基，同时用100ng/mL的人重组activin A处理24h，接着用10ng/mL的人重组BMP4处理4d，之后更换为不带诱导剂的1640-B27培养基，每隔2～3d换1次培养基，持续2～3周。大量的自发跳动心肌细胞在activin A加入后12d开始出现。

2.3 免疫荧光染色、膜片钳实验及细胞凋亡-Hoechst染色 在铺有22mm×22mm盖玻片的24孔板中，将人胚胎干细胞诱导分化为跳动的心肌细胞。然后经过心肌细胞常规免疫荧光染色步骤处理；选择有cTnT表达的跳动心肌细胞用于膜片钳实验。应用电流钳技术记录心肌细胞的自发性动作电位。在三气细胞培养箱中缺氧培养（5%CO2，95%N2）跳动的心肌24h，刺激细胞发生凋亡后，使用Hoechst染色，再进行流式细胞仪进行分析。

2.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验及多因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞形态和免疫染色 光镜下可见人胚胎干细胞克隆生长形态及悬浮法诱导形成人胚胎干细胞拟胚体（EB）形态（见封三图1）。分化培养7d左右，各组克隆开始出现跳动的区域（有录像保存）。胚胎干细胞分化为跳动克隆后，经免疫荧光染色心肌细胞特异性标志物cTnT，可以看到几乎整个克隆都呈阳性；通过膜片钳实验，两组跳动心肌细胞均检测到自发性动作电位（见封三图2）。

3.2 各组胚胎干细胞开始出现跳动克隆的时间比较每组胚胎干细胞接种96个孔，每个孔1个EB。悬浮法组出现自发跳动心肌细胞的平均时间为（13.9±0.9）天，贴壁法组出现自发跳动心肌细胞的平均时间为（13.0±1.1）天，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见封三图 3A。

3.3 各组胚胎干细胞诱导分化出现跳动EB的平均频率 悬浮法组出现自发跳动心肌细胞的平均跳动频率为（63.8±5.6）次/分；贴壁法组出现自发跳动心肌细胞的平均跳动频率为（63.0±7.0）次/分。两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见封三图3B。

3.4 分化过程中两组胚胎干细胞分化为跳动克隆的数量比较 悬浮法组分化为跳动克隆的百分比为20.8%，贴壁法组分化为跳动克隆的百分比为66.7%，表明贴壁法诱导分化效率明显高于悬浮法（P＜0.05）。见封三图4。另外，诱导出现的跳动心肌细胞维持跳动的时间可长达3个月以上。

3.5 各组心肌细胞凋亡比例 悬浮法组心肌细胞凋亡比例为（8.1±0.4）%，贴壁法组心肌细胞凋亡比例为（8.0±0.5）%。两组凋亡比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见封三图 3C、图 5。

4 讨论

人胚胎干细胞基因调控技术、体外诱导分化技术、移植技术、体内扩增技术等，均为现今各国专家研究的热点[8-11]。

实验表明，与悬浮法比较，直接贴壁法诱导分化为心肌细胞的效率更高，所需时间也更短（P＜0.05），而两组最后诱导出的心肌细胞在活性方面、抗凋亡能力方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。但直接贴壁法用到的部分实验耗材，如activin A、BMP4、bFGF等相对比较昂贵，所以当需要大量制备心肌细胞时这些成本必须要考虑在内。而悬浮法诱导分化为心肌细胞尽管分化效率较低，但是制备成本较低，也更加实用。两种实验方法在分化为跳动的心肌细胞所需时间上有一个共同点，就是前1周几乎没有跳动的心肌细胞出现，从第2周左右开始呈爆发性指数式增长，我们猜测是心肌细胞内的肌蛋白纤维含量以及自律传导系统大概需要2周左右的时间才能发育完全，最终产生心肌细胞的收缩。另外，直接贴壁法诱导分化为心肌细胞的步骤相对悬浮法虽然更为复杂，但具有进一步优化步骤的可能（如诱导因子剂量的调控、诱导因子培育的时间等），后续的试验将有可能进一步提高其诱导分化效率，那么这种方法的价值也将更加凸显。

［1］Iancu CB，Iancu D，Rentea I，et al.Molecular signatures of cardiac stem cells［J］.Rom J Morphol Embryol，2015，56（4）：1255-1262.

［2］ Di Felice V，Zummo G.Stem cell populations in the heart and the role of Isl1 positive cells［J］.Eur J Histochem ，2013，57（2）：83-85.

［3］ Santini MP，Forte E，Harvey RP，et al.Developmental origin and lineage plasticity of endogenous cardiac stem cells［J］.Development，2016，143（8）：1242-1258.

［4］ Engels MC，Rajarajan K，Feistritzer R，et al.Insulin-like growth factor promotes cardiac lineage induction in vitro by selective expansion of early mesoderm［J］.Stem Cells，2014，32（6）：1493-1502.

［5］Zelinka CP，Volkov L，Goodman ZA，et al.mTor signaling is required for the formation of proliferating Müller glia-derived progenitor cells in the chick retina［J］.Development，2016，143（11）：1859-1873.

［6］Todd L，Volkov LI，Zelinka C，et al.Heparin-binding EGF-like growth factor（HB-EGF）stimulates the proliferation of Müller glia-derived progenitor cells in avian and murine retinas［J］.Mol Cell Neurosci，2015，69：54-64.

［7］ Gallina D，Todd L，Fischer AJ.A comparative analysis of Müller glia-mediated regeneration in the vertebrate retina［J］.Exp Eye Res，2014，123：121-130.

［8］ Todd L，Fischer AJ.Hedgehog signaling stimulates the formation of proliferating Müller glia-derived progenitor cells in the chick retina［J］.Development，2015，142（15）：2610-2622.

［9］Gorsuch RA，Lahne M，Yarka CE，et al.Sox2 regulates Müller glia reprogramming and proliferation in the regenerating zebrafish retina via Lin28 and Ascl1a［J］.Exp Eye Res，2017，161：174-192.

［10］Ringuette R，Atkins M，Lagali PS，et al.A Notch-Gli2 axis sustains Hedgehog responsiveness of neural progenitors and Müller glia［J］.Dev Biol，2016，411（1）：85-100.

［11］ Nomura-Komoike K，Saitoh F，Komoike Y，et al.DNA Damage Response in Proliferating Müller Glia in the Mammalian Retina［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2016，57（3）：1169-1182.