组织工程组织血管化的研究进展

贾智明　郭海林　陈方

组织工程技术近年来取得了巨大的进步，但是组织工程组织植入体内后产生的血管化不足，成为阻碍其临床应用的主要瓶颈之一[1]。血管发生（Vasculogenesis）和/或血管新生（Angiogenesis）机制，是使构建的工程组织和器官内及时形成密集有序的血管网络的基础，是确保其在体内存活并发挥功能的必要条件[2]。由于目前组织工程组织血管化策略的不同，我们将分别进行综述，并探讨今后可能的发展趋势。

1　将支架材料特殊处理以促进血管化

将支架材料经过特殊处理后，可刺激周围组织或种子细胞分泌血管生成因子，并募集内皮细胞等，以发挥促血管化的功能[3]。

1.1　人工合成聚合物复合活性材料以促进血管化

Zhao等[4]发现，复合3.0%CuO的硼酸盐生物活性玻璃微纤维可促进内皮细胞迁移、组装血管和分泌VEGF，并上调成纤维细胞内血管形成相关基因的表达水平；体内实验证实，这种支架材料可促进全层皮肤缺损的修复。Qin等[5]将复合了1%锶的聚磷酸钙支架与人牙髓细胞共培养，以聚磷酸钙支架和羟基磷灰石支架作为对照，发现实验组不但可促进牙髓细胞增殖，还可显著刺激细胞分泌更多的VEGF和bFGF，提示复合1%锶的聚磷酸钙支架在诱导牙齿组织血管化方面具有一定的潜能。由于目前制造技术和材料本身的限制，如炎症反应、降解产物毒性，人工合成聚合物支架与种子细胞或机体相互作用仍不足，体外尚不能构建成熟稳定的血管网络，需要进一步优化。

1.2　改进天然生物材料以促进血管化

天然生物材料有着亲近的侧链和良好的生物相容性，易与宿主血管网络整合。Wang等[6]使用脂肪酸对玉米蛋白多孔支架进行改性处理，体内实验发现其生物相容性较佳，与未处理组相比在支架内形成了更为密集的微血管网络，纤维化程度轻微。Chan等[7]使用Ⅰ型牛胶原蛋白制作成80μm孔径的胶原支架，将其环绕于股动脉周围，结果显示此支架生物相容性较佳，可改善移植细胞的存活率，且支架内充满股动脉分支小血管。有研究发现，纤维蛋白和Ⅰ型胶原复合物的组成比例、硬度和机械刺激可影响血管网络的构建[8]。天然生物材料应用于组织工程血管化领域存在着自身的局限性，如胶原机械性能较差；纤连蛋白成本太高，机械应力过大不利于血管网络形成[3]。目前的研究多致力于对天然生物材料进行改良、复合，或探索新的天然生物材料等，对促进工程组织血管化的影响[9-10]。

1.3　制备人工/天然材料复合物以促进血管化

大部分人工合成聚合物属于生物惰性材料，但机械强度较大，重复性较好；天然生物材料具有良好的生物相容性，为血管形成提供了接近机体的微环境，但多缺乏机械强度。由两者复合形成的支架材料能够综合各自的优势并弥补不足，从而更好地促进血管化。Quinlan等[11]将生物活性玻璃/胶原-黏多糖支架用于骨组织工程，体外实验显示，生物活性玻璃颗粒直径为100μm时，可显著促进支架内的内皮细胞分泌VEGF，并促进内皮细胞成管；同时，该支架可促进成骨细胞的增殖和成骨作用。Koc等[12]以壳聚糖/羟基磷灰石复合支架构建组织工程化骨组织，同样取得了不错的效果。

1.4　使用脱细胞基质促进血管化

脱细胞基质含有组织特异性的血管网络骨架和活性细胞因子，通过内皮细胞再覆盖可形成功能性的血管通道。Gálvez-Montón等[13]将人心包来源的脱细胞基质覆盖于梗死心肌上方，30 d后脱细胞基质内可见微血管网络和神经纤维新生，同时左心室射血分数和心输出量等心功能指标显著改善，梗死面积显著缩小。Iyyanki等[14]将复合脂肪干细胞的脱细胞真皮基质用于修补大鼠腹壁疝，术后4周时复合脂肪干细胞可显著增加微血管密度和机械强度。脱细胞基质可在全器官组织工程领域发挥其独特的优势，值得进一步研究[15]。

1.5　应用3D打印技术构建含血管通道的特殊支架

3D打印技术是在断层扫描的基础上，通过计算机模拟出立体形态，并最终完成立体形态重建的新兴技术。使用3D打印技术可精确地、个性化地定制靶组织或器官、含有血管通道的支架，以促进工程组织的血管化。Li等[16]使用3D打印技术构建磷酸钙骨水泥复合介孔二氧化硅支架，具有特定的孔隙结构，可优化硅离子的释放，在植入体内早期可促进周围血管的长入。Bertassoni等[17]以琼脂糖为基本结构，使用异丁烯酸酯凝胶、聚乙二醇酯和二甲基丙烯酸构建了一种含有微血管通道的支架，微血管通道可完成细胞物质交换，提供细胞生长空间，支持内皮细胞的黏附、增殖等。但是，由于原材料的选择有限、制作时间较长、打印分辨率较低等原因，目前使用3D打印制作的支架和血管通道在生物相容性、血管支撑力、血管树形成等方面尚不尽如人意，需要进一步改进。

2　添加血管生成相关细胞以促进血管化

血管生成相关细胞包括：①直接相关细胞，包括内皮细胞、周细胞和血管平滑肌细胞等；②间接相关细胞，包括内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell，EPC）、间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）和诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）等，此类细胞可通过旁分泌促血管生成因子或直接分化为内皮细胞的方式促进血管化。为促进工程组织血管化，将支架材料复合血管生成相关细胞是一种可行的策略[18-19]。Buitinga等[20]将胰岛细胞复合hBMSC和脐静脉内皮细胞植入裸鼠皮下，与不含内皮细胞的对照组相比，其形成的组织微血管密度更高，可能是hBMSC和内皮细胞相互作用，而分泌了大量VEGF、bFGF等血管生成因子。因为内皮细胞来源较为局限，多取材于大动脉或者脐静脉，增殖能力较差，且有研究发现单用内皮细胞在体内并不能形成成熟稳定的血管网络。另外，由于干细胞分化为成熟内皮细胞的技术尚不成熟，EPC被认为是替代内皮细胞的理想选择[21]。Zigdon-Giladi等[22]将复合人外周血EPC的β-磷酸钙材料植入颅盖骨再生裸鼠模型，发现形成的新生骨组织血管密度高于单纯β-磷酸钙材料组7.5倍。人外周血EPC可分化为成熟的内皮细胞，并形成微血管网络与周围的宿主血管相连接。脂肪微血管片段（Microvascular fragment）的发现也为组织工程血管化提供了新的细胞来源[23]，微血管片段不仅可释放血管生成因子（A ngiogenic factor，AF），而且含有许多脂肪干细胞和EPC，其中的脂肪干细胞相对于使用传统方法得到的脂肪干细胞具有更强的分化和促血管生成能力[24]。微血管片段具有正常的血管形态学结构，含有中央腔，周围包绕有内皮细胞和壁细胞，仅需要相互连接便可形成微血管网络，可大大缩短血管化所需时间[23]。有研究将微血管片段应用于肌肉和骨组织工程，取得了较好的血管化效果[25-26]。工程组织血管化需要多种细胞参与，最近的研究发现，周细胞、血管平滑肌细胞对于新生血管的稳定和功能化非常重要，且不同动、静脉或者不同组织器官的内皮细胞存在形态学和功能学差异，应在后续研究中加以注意[3]。

3　添加血管生成因子或采用基因修饰方法以促进血管化

应用AF包被，或与支架材料共价结合，是促进工程组织血管化的常用策略。Kim等[27]将VEGF包被于介孔二氧化硅纳米微粒，然后将其融合于Ⅰ型胶原海绵构建复合支架，体外检测VEGF可持续释放超过28 d。鸡胚绒毛尿囊膜实验显示，该复合支架与未添加VEGF的支架相比，可诱导更多的血管生成。然而，单一的AF通常并不能有效诱导形成成熟的血管网络，可能会导致血管瘘、出血等并发症。血管生成是一系列血管生成因子复杂调控的动态过程，且不同的AF在血管生成过程中的作用及作用靶点不同，因此联合有序地应用多种AF非常关键[28-30]。Jiang等[31]将包被有VEGF和bFGF纳米微球的膀胱脱细胞基质用于膀胱缺损修补，结果显示实验组可显著改善新生膀胱组织挛缩现象，且新生组织的尿路上皮细胞、肌细胞排列情况，以及微血管密度和成熟度均优于单独应用VEGF或bFGF组。由于不同AF的药物释放动力学不尽相同，为了达到最佳的促血管化效果，目前AF的释放方式有待精细调控。此外，尚不清楚不同AF组合应用，对促血管化的效果，有待进一步的研究探讨。

基因修饰有利于促血管生成相关基因的长期稳定表达。Zhang等[32]将编码Hif-1的腺病毒载体复合明胶海绵，治疗牙槽骨缺损大鼠模型，体外检测Hif-1可持续释放21 d，与对照组相比，可显著诱导新生骨形成和血管生成。Zeng等[33]将转染miRNA-210的慢病毒载体立体定位注射至小鼠大脑，与未转染组小鼠相比，实验组内皮细胞增殖速度、新形成的微血管数目显著增加。通过基因修饰进行血管生成因子的时间和空间调控是一个非常具有前景的血管化策略，但可能存在致癌风险，需要细胞筛选和精细调控，以使得释放的AF维持在理想水平，且需要长期随访，观察血管生成之后AF的继续释放对新生血管的影响[2]。

4　预血管化方法以促进工程组织的血管化

预血管化是在上述三种血管化策略基础上，在移植靶位置之前存在特定的体外或体内孵育血管网络的阶段。预血管化策略包括体外和体内两种途径。体外途径主要指在体外培养血管生成相关细胞，形成微血管网络后进行体内移植。体内途径指将构建的工程组织先植入宿主体内血管丰富的部位，使得周围血管长入组织，然后再将组织移植靶位置。

4.1　体外构建预血管化的工程组织

在体内移植之前，将内皮细胞等血管生成相关细胞植入支架材料，然后在特定的体外环境下孵育微血管网络，以缩短工程组织移植体内后血管网络形成的时间[21]。有研究将内皮细胞与其他细胞共培养构建细胞微球，经短期体外孵育即可形成含有密集微血管网络的工程组织[34]。与单细胞相比，细胞微球含有更为紧密的细胞间联系和细胞-细胞外基质联系，具有更强的分化潜能，更能耐受缺氧环境，并具有更强的促血管化能力[21]。Sakaguchi等[35]将3层心肌细胞-内皮细胞共培养细胞片反复叠加于灌注有培养基的微通道胶原凝胶上方，其中的内皮细胞可组装成微血管并向胶原凝胶内迁移，与胶原凝胶内的微通道建立连接，肉眼可见通过叠加细胞片构建的工程心肌组织同步收缩。Zhang等[36]利用微通道技术，构建含有可灌注微血管的心肌组织，并可与大鼠股动静脉通过手术吻合。近年来，随着微流控、大规模生物反应器等新技术的迅速发展，在体外构建复杂有序的微血管网络正逐渐变成可能[37]。

4.2　体内构建含轴心血管的工程组织

体内预血管化以往常采用的方法是将支架置入体内血供丰富和容易操作的位置，如皮下或者肌肉“口袋”。尽管上述方法可使构建的组织血管化，但其移植到靶位置后仍需要较长时间与宿主血管连通，可能会造成细胞缺血死亡。因此，新的体内预血管化策略相继出现，如动静脉环路、含轴心血管的组织瓣技术等[21]。Tatara等[38]将聚甲基丙烯酸甲酯小室固定于肋骨膜上，室内填充成骨材料；在小室内骨组织新生的同时，骨膜血管网通过出芽方式长入新生骨组织内，从而获得血管化的骨组织。由于肋骨膜血管网与邻近的肋间动静脉相互连通，从而构建出以肋间动静脉为轴心血管的游离骨组织瓣，并成功地以此进行了下颌骨缺损修复。上述策略可使工程组织血管与靶点附近血管吻合，移植后可立即形成血流灌注。Kaempfen等[39]将种植有B MSC的脱细胞骨基质分别以3种方式修补兔节段性肱骨缺损模型：①直接原位移植；②被以腋动脉分支血管为轴心血管的肌肉瓣包裹后岛状移植至缺损处；③被以腋动脉分支为轴心血管的肌肉瓣包裹并体内孵育6周，然后再岛状移植至缺损处。结果发现，采用第3种方式构建的工程骨组织血管密度明显高于另两种。体内预血管化需较长时间才能实现最初的血管化，并可能导致机体创伤，微创、简便、有效地体内预血管化是将来的研究方向。

5　展望

组织工程组织血管化已经取得了积极的进展，但对于较厚的复杂组织器官，血管化不足仍是亟待解决的难题。为实现工程组织及器官的充分血管化，单纯地依赖一种血管化策略效果较差，根据不同的靶向器官组织，个性化地联合应用多种血管化策略可能是今后的发展趋势[3，21，40]。此外，今后还需通过长期观察以探讨新生血管的转归，从而验证其有效性和安全性。iPSC、脂肪微血管片段、细胞片技术、微流控技术等的应用，为工程化组织的血管化研究提供了新的工具[21]。非编码RNA、炎症反应和血管生成主调控因子（如低氧诱导因子-1的调控）可能是影响工程组织血管化的主要机制，为组织工程血管化提供了理论基础[41]。血管化的基础是内皮细胞、壁细胞等血管生成细胞的组装成管、稳定成熟，关键是细胞因子等微环境因素的调控。由于目前工程技术和细胞技术的限制，尚无理想的解决办法，借助于体内轴心血管、利用体内微环境孵育血管化，或许是目前最佳的解决办法。随着工程学、生物学、临床医学等的密切合作和血管化策略的不断进展，相信不久组织工程血管化不足的难题将会得到解决。

[1]Kim JJ,Hou L,Huang NF.Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications[J].Acta Biomater,2016,41：17-26.

[2]Moya ML,Brey EM.Vascularization of Engineered Tissues[M]//Bronzino JD,Peterson DR,ed.Molecular,Cellular,and Tissue Engineering.Boca Raton：CRC Press,2015：62.

[3]Sarker M,Chen XB,Schreyer DJ.Experimental approaches to vascularizationwithintissueengineeringconstructs[J].J Biomater Sci Polym Ed,2015,26(12)：683-734.

[4]Zhao S,Li L,Wang H,et al.Wound dressingscomposed of copperdoped borate bioactive glass microfibers stimulate angiogenesis and heal full-thickness skin defects in a rodent model[J].Biomaterials,2015,53：379-391.

[5]Qin H,Yang Z,Li L,et al.A promising scaffold with excellent cytocompatibility and pro-angiogenesis action for dental tissue engineering：Strontium-doped calcium polyphosphate[J].Dent Mater J,2016,35(2)：241-249.

[6]Wang HJ,Huang JC,Hou L,et al.Prolongation of the degradation period and improvement of the angiogenesis of zein porous scaffolds in vivo[J].JMater Sci Mater Med,2016,27(5)：92.

[7]Chan EC,Kuo SM,Kong AM,et al.Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications[J].PLoSOne,2016,11(2)：e0149799.

[8]Brougham CM,Levingstone TJ,Jockenhoevel S,et al.Incorporation of fibrin into a collagen-glycosaminoglycan matrix results in a scaffold with improvedmechanical properties and enhanced capacity to resist cell-mediated contraction[J].Acta Biomater,2015,26：205-214.

[9]Gigliobianco G,Chong CK,MacNeil S.Simple surface coating of electrospun poly-L-lactic acid scaffolds to induce angiogenesis[J].JBiomater Appl,2015,30(1)：50-60.

[10]Carpena NT,Abueva CDG,Padalhin AR,et al.Evaluation of egg whiteovomucin-based porous scaffold as an implantable biomaterial for tissue engineering[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2017,105(7)：2107-2117.

[11]Quinlan E,Partap S,Azevedo MM,et al.Hypoxia-mimicking bioactive glass/collagen glycosaminoglycan composite scaffolds to enhance angiogenesis and bone repair[J].Biomaterials,2015,52：358-366.

[12]Koc A,Finkenzeller G,Elcin AE,et al.Evaluation of adenoviral vascular endothelial growth factor-activated chitosan/hydroxyapatite scaffold for engineering vascularized bone tissue using human osteoblasts：In vitro and in vivo studies[J].J Biomater Appl,2014,29(5)：748-760.

[13]Gálvez-Montón C,Fernandez-Figueras MT,MartíM,et al.Neoinnervation and neovascularization of acellular pericardialderived scaffolds in myocardial infarcts[J].Stem Cell Res Ther,2015,6：108.

[14]Iyyanki TS,Dunne LW,Zhang Q,et al.Adipose-derived stemcell-seeded non-cross-linked porcine acellular dermal matrix increases cellular infiltration,vascular infiltration,and mechanical strength of ventral hernia repairs[J].Tissue Eng Part A,2015,21(3-4)：475-485.

[15]Guyette JP,Charest JM,Mills RW,et al.Bioengineering human myocardium on native extracellular matrix[J].Circ Res,2016,118(1)：56-72.

[16]Li C,Jiang C,Deng Y,et al.RhBMP-2 loaded 3D-printed mesoporous silica/calciumphosphate cement porous scaffolds with enhanced vascularization and osteogenesis properties[J].Sci Rep,2017,7：41331.

[17]Bertassoni LE,Cecconi M,Manoharan V,et al.Hydrogel bioprinted microchannel networks for vascularization of tissue engineering constructs[J].Lab Chip,2014,14(13)：2202-2211.

[18]Sun W,Motta A,Shi Y,et al.Co-culture of outgrowth endothelial cells with human mesenchymal stem cells in silk fibroin hydrogels promotes angiogenesis[J].Biomed Mater,2016,11(3)：035009.

[19]Li Z,Ba R,Wang Z,et al.Angiogenic potential of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in chondrocyte brickenriched constructs promoted stable regeneration of craniofacial cartilage[J].Stem Cells Transl Med,2017,6(2)：601-612.

[20]Buitinga M,Janeczek Portalska K,Cornelissen DJ,et al.Coculturing human islets with proangiogenic support cells to improve islet revascularization at the subcutaneous transplantation site[J].Tissue Eng Part A,2016,22(3-4)：375-385.

[21]Laschke MW,Menger MD.Prevascularization in tissue engineering：Current concepts and future directions[J].Biotechnol Adv,2016,34(2)：112-121.

[22]Zigdon-Giladi H,Michaeli-Geller G,Bick T,et al.Human bloodderived endothelial progenitor cells augment vasculogenesis and osteogenesis[J].JClin Periodontol,2015,42(1)：89-95.

[23]Laschke MW,Menger MD.Adipose tissue-derived microvascular fragments：natural vascularization units for regenerative medicine[J].Trends Biotechnol,2015,33(8)：442-448.

[24]McDaniel JS,Pilia M,Ward CL,et al.Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments[J].JSurg Res,2014,192(1)：214-222.

[25]Pilia M,McDaniel JS,Guda T,et al.Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury[J].Eur Cell Mater,2014,28：11-23.

[26]Laschke MW,Grasser C,Kleer S,et al.Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity[J].Eur Cell Mater,2014,28：287-298.

[27]Kim JH,Kim TH,Kang MS,et al.Angiogenic effects of collagen/mesoporous nanoparticle composite scaffold delivering VEGF(165)[J].Biomed Res Int,2016,2016：9676934.

[28]Lakshmanan R,Kumaraswamy P,Krishnan UM,et al.Engineering a growth factor embedded nanofiber matrix niche to promote vascularization for functional cardiac regeneration[J].Biomaterials,2016,97：176-195.

[29]Said SS,O'Neil C,Yin H,et al.Concurrent and sustained delivery of FGF2 and FGF9 from electrospun Poly(ester amide)fibrous mats for therapeutic angiogenesis[J].Tissue Eng Part A,2016,22(7-8)：584-596.

[30]Roelofs LA,Oosterwijk E,Kortmann BB,et al.Bladder regeneration usinga smart acellular collagen scaffold with growth factors VEGF,FGF2 and HB-EGF[J].Tissue Eng Part A,2016,22(1-2)：83-92.

[31]Jiang X,Lin H,Jiang D,et al.Co-delivery of VEGF and bFGF via a PLGA nanoparticle-modified BAM for effective contracture inhibition of regenerated bladder tissue in rabbits[J].Sci Rep,2016,6：20784.

[32]Zhang Y,Huang J,Wang C,et al.Application of HIF-1αby gene therapy enhances angiogenesis and osteogenesis in alveolar bone defect regeneration[J].JGene Med,2016,18(4-6)：57-64.

[33]Zeng L,He X,Wang Y,et al.MicroRNA-210 overexpression induces angiogenesis and neurogenesis in the normal adult mouse brain[J].Gene Ther,2014,21(1)：37-43.

[34]Walser R,Metzger W,Gorg A,et al.Generation of co-culture spheroids as vascularisation units for bone tissue engineering[J].Eur Cell Mater,2013,26：222-233.

[35]Sakaguchi K,Shimizu T,Horaguchi S,et al.In vitro engineering of vascularized tissue surrogates[J].Sci Rep,2013,3：1316.

[36]Zhang B,Montgomery M,Chamberlain MD,et al.Biodegradable scaffold with built-in vasculature for organ-on-a-chip engineering and direct surgical anastomosis[J].Nat Mater,2016,15(6)：669-678.

[37]Heintz KA,Bregenzer ME,Mantle JL,et al.Fabrication of 3D biomimetic microfluidic networks in hydrogels[J].Adv Healthc Mater,2016,5(17)：2153-2160.

[38]Tatara AM,Kretlow JD,Spicer PP,et al.Autologously generated tissue-engineered boneflapsfor reconstruction of largemandibular defects in an ovine model[J].Tissue Eng Part A,2015,21(9-10)：1520-1528.

[39]Kaempfen A,Todorov A,Güven S,et al.Engraftment of prevascularized,tissue engineered constructs in a novel rabbit segmental bone defect model[J].Int JMol Sci,2015,16(6)：12616-12630.

[40]Dew L,MacNeil S,Chong CK.Vascularization strategies for tissue engineers[J].Regen Med,2015,10(2)：211-224.

[41]Lam GC,Sefton MV.Harnessing gene and drug delivery for vascularizing engineered tissue platforms[J].Drug Discov Today,2016,21(9)：1532-1539.