不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶和细胞外调节蛋白激酶表达的影响

贲定严++宁炯杰++徐寅++罗燕++李木清++王云辉++易展?

摘要：目的 观察不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶（MEK）1/2和细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2表达的影响，探讨隔姜灸治疗脾虚证的可能作用机制及量效特征。方法 将75只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、隔姜灸3壮组、隔姜灸6壮组、隔姜灸9壮组，每组15只。200%大黄浓缩液4 ℃灌胃制作脾虚证大鼠模型。造模成功后，隔姜灸组选取“足三里”“中脘”予不同灸量治疗，连续8 d。HE染色镜下观察大鼠胃组织病理学改变，免疫组化检测大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2的蛋白表达。结果 与空白对照组比较，模型组大鼠胃黏膜损伤明显，可见较大的破损、脱落；与模型组比较，隔姜灸3壮组大鼠胃黏膜表面有部分脱落、破损情况改善，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组大鼠胃黏膜表面较完整、脱落及破损明显改善。与空白对照组比较，模型组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，隔姜灸各组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白明显表达升高（P<0.01）；与隔姜灸3壮组比较，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高（P<0.01），但二者作用效果相当，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 隔姜灸通过提高胃组织MEK1/2及ERK1/2的蛋白表达，激活MEK/ERK信号转导通路，进而促进脾虚证大鼠胃黏膜的修复。

关键词：灸量；隔姜灸；脾虚证；胃黏膜增殖修复；丝裂原细胞外激酶；细胞外調节蛋白激酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.012

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）01-0054-05

Effects of Different Dosages of Moxibustion with Ginger-Separated Moxibustion on MEK1/2 and ERK1/2 of Gastric Tissue in Rats with Spleen Deficiency

BI Ding-yan1， NING Jiong-jie1， XU Yin2， LUO Yan3， LI Mu-qing1， WANG Yun-hui1， YI Zhan1

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

3. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China

Abstract： Objective To observe effects of different dosages of moxibustion with ginger-separated moxibustion on expressions of mitogen extracellular kinase （MEK） 1/2 and extracellular regulated protein kinase （ERK） 1/2 of gastric tissue in rats with spleen deficiency； To explore the possible mechanism and the dose-effect relationship. Methods Seventy-five SD rats were randomly divided into blank control group， model group， ginger-separated moxibustion for three zhuang group， six zhuang group and nine zhuang group according to random digits table method， with fifteen rats in each group. The rat model of spleen deficiency was established by intragastric administration with 200% Rhei Radix et Rhizoma infusion at 4 ℃. Ginger-separated moxibustion groups were treated with different dosage of moxibustion at “Zusanli”， “Zhongwan” for eight days after the modeling. Pathological changes of gastric tissue by HE staining were observed under light microscope， and immunohistochemistry was used to detect the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue of rats. Results Compared with the blank

基金项目：湖南省教育厅科研计划项目（13C685）；湖南省研究生科研创新项目（CX2016B351）

通讯作者：易展，E-mail：2271813059@qq.com

control group rats， the gastric mucosa injury in the model group was obvious， which showed that the damage and abscission was more serious； compared with the model group， the gastric mucosa of rats was partly exfoliated and the damage was improved in three zhuang group， and the surface of gastric mucosa of rats was more complete and damage was improved obviously in six zhuang group and nine zhuang group； compared with the blank control group， the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue increased obviously in other groups （P<0.01）； compared with three zhuang group， the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue increased in six zhuang group and nine zhuang group （P<0.01）， but the effects of the two group were similar， without statistical significance （P>0.05）. Conclusion Ginger-separated moxibustion can repair gastric mucosa in rats with spleen deficiency， which may be closely associated with its effect in increasing the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue and activating the MEK/ERK signal transduction pathway.endprint

Keywords： dosage of moxibustion； ginger-separated moxibustion； spleen deficiency； proliferation and restoring of gastric mucosa； mitogen activated protein kinase； extracellular regulated protein kinase； rats

脾虚证是指脾气虚弱导致脾失运化的病证，是消化性溃疡、慢性胃炎等消化系统疾病的常见中医证型。有研究发现，脾虚大鼠胃底部黏膜缺损、炎细胞浸润、血管扩张充血、黏膜下层水肿[1]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号传导通路作用于核转录因子，与细胞增殖和凋亡关系密切，并参与胃黏膜炎症及损伤过程，其中丝裂原细胞外激酶（MEK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）是MAPK信号传导通路中的关键环节[2-3]。临床研究显示，针灸治疗脾胃虚寒证胃炎疗效确切，尤其是艾灸疗法的作用更加明显[4]。前期研究表明，隔姜灸不仅能改善脾胃虚寒证患者的临床症状，还具有抗氧化等良性调节作用[5]。本实验在前期研究的基础上，观察不同灸量隔姜灸对MEK1/2及ERK1/2蛋白表达的影响，从MEK/ERK信号通路角度探讨不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃黏膜的保护作用及量效特征，以期为隔姜灸治疗脾虚证的临床运用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

雌性健康SD大鼠75只，SPF级，月龄2～3月，体质量200～250 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2011-0003。饲养于温度20～25 ℃、相对湿度50%～70%环境。75只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、隔姜灸3壮组、隔姜灸6壮组、隔姜灸9壮组，每组15只。

1.2 主要试剂与仪器

艾条，南阳市卧龙汉医艾绒厂；生姜片，厚2～3 mm，直径1.8 cm；ERK1/2试剂盒（美国Proteintech Group公司），MEK1/2试剂盒（英国Abcam公司），石蜡、中性树胶（美国Sigma公司），苏木素、PBS、枸橼酸盐缓冲液、二步法试剂盒（Wellbio公司），DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），常规化学试剂（国药控股上海生物医药有限公司）。摇床（其林贝尔仪器制造有限公司），恒温箱（北京六一仪器厂），微波炉（美的集团），切片刀（德国莱卡），包埋机（常州中威电子仪器有限公司），精密pH计（雷磁上海仪电科学仪器股份有限公司），显微镜（Motic实业集团有限公司）。

1.3 造模

参考文献[6]方法造模。每只大鼠200%大黄浓缩液（1 mL/100 g）4 ℃灌胃，每日2次，连续14 d。观察大鼠体质量、饮食饮水量、皮肤毛色、大便情况、精神状态、行为活动等变化。200%大黄浓缩液制备方法：生大黄购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，10 g/包，加入100 ℃蒸馏水煮沸5 min，然后用4层纱布过滤3～4次，再用100 ℃水浴浓缩至200%（相当于2 mg原药材/mL），4 ℃保存备用。参照文獻[6]制定脾虚证动物模型评价标准。主症：①泄泻，严重时脱肛；②食少纳呆。兼症：①形体消瘦，体质量减轻；②神态萎靡不振，四肢不收，毛色枯槁无华；③蜷缩聚堆；④容易疲劳。具备2项主症和2项兼症可认为脾虚证模型造模成功。

1.4 取穴

参照《实验针灸学》[7]中常用动物穴位定位法及拟人对照法，以胸锁联合和耻骨联合连线下1/4与上3/4交点为肚脐。足三里：膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处；中脘：脐与胸骨剑突连线中点，约脐上20 mm处。

1.5 干预及取材

造模成功后，剪除大鼠穴位区2 cm×2 cm鼠毛，暴露局部皮肤组织，酒精消毒。用自制大鼠固定夹将大鼠仰卧位固定，待大鼠安静后进行艾灸治疗。隔姜灸治疗组：将放有艾炷（7 mm×9 mm）的姜片固定于穴位区，点燃施灸，待艾炷燃尽后换下一壮，各隔姜灸治疗组分别按每穴每日3壮、6壮、9壮的灸量，连续治疗8 d。空白对照组与模型组大鼠只固定不作处理。治疗完成后，大鼠禁食24 h，禁水6 h，用10%乌拉坦（1 mL/100 g）麻醉后剖腹，将胃幽门部和贲门部用止血钳结扎，在两结扎线两端切断食道及十二指肠，摘下全胃。沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗胃内残留物。在超净工作台下，于胃黏膜损伤明显处，取1 cm×0.5 cm大小的组织块，生理盐水冲洗干净，置于4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h，切片（厚度5 ?m），备检。

1.6 指标检测

采用免疫组化检测ERK1/2、MEK1/2的蛋白表达。①60 ℃烤片45 min；②切片脱蜡至水（先将切片置于二甲苯中10 min×2次，然后依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中5 min，再用蒸馏水冲洗5 min）；③热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0），电加热至沸腾，间隔5～10 min×2次，冷却后用0.01 mol/L PBS（pH 7.2～7.6）洗涤3 min×3次；④加入3%H2O2，室温10 min灭活内源性酶，PBS冲洗3 min×3次；⑤孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（MEK1/2为1∶300、ERK1/2为1∶100），4 ℃过夜，PBS冲洗5 min×3次；⑥孵育二抗：滴加50～100 μL兔抗鼠IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次；⑦DAB显色：滴加预制好的显色剂DAB工作液50～100 μL，室温孵育1～5 min，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；⑧苏木素复染5～10 min，1%盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；⑨梯度乙醇（60%～100%）脱水，每级5 min，取出后置于二甲苯中10 min，反复2次。中性树胶封片，显微镜观察，采用ImagePro Plus图像分析软件分析。endprint

1.7 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，符合正态分布采用方差分析，方差齐用LSD或SNK法，方差不齐用Tamhane's T2或Dunnett's T3法，不符合正态分布采用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

空白对照组大鼠体质量和食量保持稳定，动作敏捷好动，精神状态良好，大便干燥成型，毛色光泽；造模后大鼠体质量增长缓慢，食量下降，活动减少，喜蜷卧，大便溏泄，毛色不泽；隔姜灸各组干预8 d后，食欲增强，活动增加，精神状况明显改善，粪质好转，毛发改善。

2.2 胃组织病理变化

空白对照组大鼠胃黏膜表面细胞完整，各层组织结构正常未见萎缩、脱落或缺损；模型组大鼠胃黏膜损伤明显，可见较大的破损脱落；与模型组比较，隔姜灸3壮组大鼠胃黏膜表面有部分脱落、破损情况改善，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组大鼠胃黏膜表面较完整、脱落及破损明显改善。结果见图1。

2.3 隔姜灸对模型大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶1/2和细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠胃组织MEK1/2和ERK1/2蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，隔姜灸各组胃组织MEK1/2和ERK1/2蛋白表达明显升高（P<0.01）；与隔姜灸3壮组比较，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组胃组织MEK1/2和ERK1/2蛋白表达明显升高（P<0.01），但二者效果相当差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1、图2和图3。

3 讨论

胃黏膜损伤是导致急慢性胃炎、胃溃疡等疾病的主要病理环节，脾虚致使脏腑功能异常，进而影响胃黏膜屏障功能，破坏胃黏膜防御机制和导致慢性胃病的发生[8]。《脾胃论·脾胃盛衰论》有“百病皆由脾胃衰而生也”，提示脾胃与人体防御功能关系密切，脾胃亏虚是消化系统疾病特别是胃黏膜局部损伤发生、发展与转归的关键。因此，在治疗上应从脾胃角度入手，纠正脾胃亏虚的病理基础，提高胃黏膜自身保护和防御功能。

灸法是最具传统特色的中医外治法之一，其温热刺激能产生良好的温通及温补效应，从而发挥养生保健和防病治病的功效[9]。隔姜灸是将生姜之辛温走窜之力，灸火之祛寒行血、温通经络之功相结合的综合治疗方法。姜艾结合施灸，发挥协同作用，效果相得益彰。《医宗金鉴·刺灸心法要诀》有“凡灸诸病，火足气到，始能求愈”，提示艾灸灸量直接影响疗效[10]，临床治病必须达到一定的灸量，才能取得最佳效果。而灸治时间是影响灸量的一个重要因素。

细胞内MAPK信号转导通路能将细胞外信号转导至细胞及细胞核内，其参与细胞凋亡、增殖及炎症性组织损伤，其核心由3种蛋白激酶构成，即Raf/MEK/ERK。Raf是分子质量为40～75 kD的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，有3种同工酶A-Raf、B-Raf和Raf-1。MEK为MAP2K家族成员，有MEK1、MEK2两个亚型，上游的Raf1蛋白激酶被活化后，其C端催化区能与MEK结合，并使催化区中的Thr和Ser磷酸化，从而激活MEK。活化的MEK能夠磷酸化酪氨酸/苏氨酸（Tyr/Thr）残基，其作用是磷酸化并激活下游底物ERK1/2，从而影响细胞生长、增殖、分化。其中，ERK是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。ERK1/2也是多种细胞外信号（激素、细胞因子、生长因子等）引起细胞增殖与分化信号转导的共同通路或汇聚点。研究表明，磷酸化的ERK1/2活性升高可刺激Caco2/15细胞株在体外的增生，当增生到一定程度后，ERK1/2活性逐步降低，细胞增殖停止并转向分化，表明ERK1/2是胃肠道细胞分化过程的重要调节因子[11]。李铁浪等[12]研究表明，艾灸通过激活TFF/ERK信号转导通路，促进脾虚胃溃疡大鼠损伤胃黏膜的增殖修复。

本研究结果显示，大黄浓缩液灌胃14 d后，大鼠体质量增长缓慢，食量下降，活动减少，喜蜷卧，大便溏泄，毛色不泽，提示造模成功。成模后采用不同灸量隔姜灸进行干预，大鼠食欲增强，活动增加，精神状况明显改善，粪质好转，毛发改善，说明不同灸量隔姜灸均能改善脾虚表现。本研究结果显示，模型组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达升高，提示大鼠胃黏膜受损后有一定的自我修复功能，激活了MEK/ERK信号转导通路，并启动胃黏膜的重建和修复；隔姜灸“足三里”“中脘”后，隔姜灸各组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达进一步升高，由此我们推断隔姜灸通过上调MEK1/2的表达，进一步提高ERK1/2的活性，激活MEK/ERK信号转导通路，进而促进脾虚证大鼠胃黏膜损伤组织的增殖修复，光镜下胃黏膜表面脱落、破损情况改善。同时与隔姜灸3壮组比较，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达升高，提示在一定范围内，随着灸量的增加，隔姜灸促进胃黏膜组织的增殖修复作用越强，但隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组作用效果相当，说明并不是灸量越大，其产生的效应越强，与光镜下胃黏膜组织的表现类似。卢明香等[13]研究不同灸量隔姜灸对高脂血症大鼠穴位局部温度的影响指出，6壮组和9壮组所达到的最高温度均比3壮组高，差异有统计学意义，而6壮组和9壮组间差异无统计意义。说明机体对隔姜灸的刺激作用可能具有一定的有效阈值范围，即适宜的灸量，当隔姜灸达到有效阈值，即达到效应的平台期，即使刺激量超过阈值，隔姜灸的刺激作用也不再增加。

综上所述，隔姜灸能促进脾虚证大鼠胃黏膜的增殖修复，其作用机制可能与升高胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达，激活MEK/ERK信号转导通路相关，且在一定范围内，随着灸量的增加，隔姜灸促进胃黏膜组织的增殖修复作用增强。

参考文献：

[1] 李晨，王垂杰.3种脾虚证模型大鼠胃黏膜损伤情况的比较[J].中国中西医结合消化杂志，2013，21（3）：127-130.endprint