薤白皂苷对血小板聚集及血小板—中性粒细胞间相互作用的影响

王志鹏++封慧++郭茗++王长松

摘要：目的 探讨薤白皂苷对血小板聚集及血小板-中性粒细胞间相互作用的影响。方法 分别于在体和离体环境下观察SD大鼠血小板聚集功能，采用玫瑰花环试验测定血小板与中性粒细胞的黏附能力，检测细胞溶质钙离子的浓度。结果 薤白皂苷离体环境下呈浓度依赖性抑制花生四烯酸（AA）、腺苷二磷酸（ADP）或血小板活化因子（PAF）诱导的血小板聚集；薤白皂苷在体环境下呈浓度依赖性抑制PAF、ADP及AA诱导的血小板聚集，5 mg/kg薤白皂苷明显抑制PAF、AA和ADP诱导的血小板聚集；薤白皂苷可降低洗涤血小板内钙离子浓度；薤白皂苷可降低中性粒细胞与凝血酶激活的血小板间的黏附，并抑制中性粒细胞上清液诱导的血小板聚集，其50%抑制浓度分别为2.7、9.6 μmol/L。结论 薤白皂苷体外和体内均可抑制血小板聚焦，抑制血小板-中性粒细胞间的相互作用。

关键词：薤白皂苷；血小板-中性粒细胞；血小板聚集

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.008

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）01-0033-05

Effects of Saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs on Platelet Aggregation

and Interactions between Platelets and Neutrophils

WANG Zhi-peng， FENG Hui， GUO Ming， WANG Chang-song

Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University， Nanjing 210009， China

Abstract： Objective To investigate the effects of saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs （SMBB） on platelet aggregation and platelet-neutrophil-interactions. Methods The effects of SMBB on platelet aggregation in SD rats were observed in vivo and in vitro. The adhesion of platelets to neutrophils was measured by rosette test. The effect of SMBB on activated platelet calcium levels was detected. Results Platelet aggregation induced by platelet activating factor （PAF）， adenosine diphosphate （ADP） and arachidonic acid （AA） was significantly inhibited by SMBB in vitro concentration-dependent. Platelet aggregation induced by PAF， AA and ADP was significantly inhibited by 5 mg/kg of SMBB. SMBB could reduce the intracellular calcium concentration in the wash platelets. SMBB significantly reduced the adhesion between neutrophils and thrombin-activated platelets and inhibited neutrophil supernatant-induced platelet aggregation， with IC50 of 2.7 μmol/L and 9.6 μmol/L， respectively. Conclusion SMBB can inhibit platelet aggregation in vitro and ex vivo， and inhibit the interactions between platelets and neutrophils.

Keywords： saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs； platelet-neutrophil interactions； platelet aggregation

傳统观点认为血小板是参与血栓形成的主要细胞，其与中性粒细胞的联系并不十分密切。近年来，更多的研究显示，中性粒细胞不仅参与了血小板聚集

基金项目：江苏省中医药管理局资助项目（YB2015180）；南京市卫生科技项目（YKK16281）

通讯作者：王长松，E-mail：kingidoc@126.com

与血栓形成过程，还通过释放多种细胞因子参与心肌梗死的整个病理机制，故认为血小板和中性粒细胞的相互作用可能是冠心病及心肌梗死发生发展的关键因素之一[1-2]。薤白有行气导滞、通阳散瘀的功效，是治疗胸痹、真心痛的要药，相关方剂“瓜蒌薤白白酒汤”“瓜蒌薤白半夏汤”“枳实薤白桂枝汤”是临床常用治疗胸痹、真心痛的名方。研究表明，薤白中皂苷类化合物通过抗血小板聚集、抗氧化、降血脂参与冠状动脉粥样硬化的整个过程[3]，但其具体微观机制并未解释。本研究旨在探讨薤白皂苷分别于在体和离体环境下对血小板活化因子（PAF）、腺苷二磷酸（ADP）及花生四烯酸（AA）诱导的血小板聚集的干预及对血小板-中性粒细胞间相互作用的影响。endprint

1 材料与方法

1.1 动物

8周龄SPF级健康雄性SD大鼠30只，体质量240～260 g，东南大学医学院实验动物中心，动物许可证号SYXK（苏）2013-0037，饲养于东南大学医学院实验动物中心SPF级实验动物房。

1.2 药物及制备

薤白皂苷：将新鲜薤白鳞茎（南京鹤龄药事服务有限公司，产地：河南省平顶山市）捣碎，先用乙醇从中提取出薤白总皂苷，然后运用多种色谱学方法分离出已知化学结构的6种薤白皂苷的混合物[4-5]。阿司匹林片，吉林集安益盛药业股份有限公司，批号20170407821，500 mg/片；维拉帕米片，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号2017010226，120 mg/片。使用前溶解于100 mmol/L Na2CO3。

1.3 主要試剂与仪器

ADP、AA、PAF和人凝血酶，Hoffmann-La Roche Ltd；钙离子荧光探针（Fura-2-AM）、N-甲酰基甲硫氨酰-亮氨酰-苯基-丙氨酸（fMLP）和二甲基亚砜（DMSO），Sigma Chemical Co.。AA和PAF溶解于PBS，于100 mmol/L Na2CO3和Tris-NaCl缓冲液分别加入0.25%牛血清白蛋白，fMLP溶解在DMSO中。高速离心机（型号GL10MA），湖南凯达科学仪器有限公司；微孔板振荡器（型号MPS40），上海达姆实业有限公司；流式细胞仪，美国BD公司；生物发光凝集测定仪，ChronoLog Corp，Havertown。

1.4 血小板制备

收集大鼠颈动脉血，用于血小板与中性粒细胞结合实验的动脉血用2.7%乙二胺酸处理，用于抗血小板聚集实验的动脉血用3.8%柠檬酸钠抗凝。分别于180×g和1000×g离心10 min，得富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP），PRP再以1000×g离心10 min，然后将细胞重悬于PBS（含有1.0%牛血清白蛋白和1 mmol/L CaCl2）中洗涤，台盼蓝拒染实验检测细胞存活率高于95%，将细胞浓度调至108/mL。

1.5 中性粒细胞制备

从剩余血液中用葡聚糖沉淀法分离出中性粒细胞，置于Ficoll-Hy-paque细胞分离液（特异性密度1.077 g/mL）中，用低渗法去除红细胞。将细胞沉淀重新悬浮于由155 mmol/L NH4Cl、2.96 mmol/L KHCO3和3.72 mmol/L乙酰胆碱组成的红细胞溶解缓冲液中，将试管倒置，5 min后，将悬浮液350×g离心10 min，PBS洗涤细胞，再重悬于含1 mmol/L CaCl2的Hank's溶液中。将细胞浓度调整为2×106/mL备用。

1.6 血小板聚集

体外血小板聚集：PRP中血小板聚集率参照文献[4]Born法进行测量。用生物发光凝集测定仪监测最大聚集率（诱导血小板聚集浓度为ADP 3 μmol/L、AA 0.35 mmol/L、PAF 7.2 nmol/L）。计算药物抑制血小板聚集率。血小板聚集率（%）=（A-B）÷A×100%。公式中A为添加对照物（生理盐水）时浊度的最大变化，B为加入药物（薤白皂苷、阿司匹林）时浊度的最大变化。50%抑制浓度（IC50）=添加抑制物值÷不添加抑制物值。

体内血小板聚集：实验大鼠随机分为生理盐水组、阿司匹林组和薤白皂苷组，每组6只，分别给予相应溶液2 mL灌胃，PRP和PPP分别在给药前和给药后60、120、180、240 min制备。用生物发光凝集测定仪监测ADP、AA或PAF诱导的血小板最大聚集率。

1.7 细胞溶质钙离子浓度测定

取上述血小板混悬液200 μL装入试管，加Fluo-3使其终浓度为4 μmol/L，37 ℃孵育30 min，再加PBS稀释50倍，流式细胞仪检测10 000个血小板的荧光强度。在1 mmol/L CaCl2条件下加Triton X-100测定最大荧光值Fmax，加入20 mmol/L钙离子螯合剂测定最小荧光值Fmin，分别加入1 mL AA（200 μmol/L），37 ℃孵育10 min，再加入0.5%DMSO、阿司匹林及0.16、0.8、4、20、100 μmol/L薤白皂苷，测定荧光值F。计算细胞内Ca2+浓度[Kd（F-Fmin）÷（Fmax-F）]，其中Kd为解离常数450 nmol/L[6]。

1.8 玫瑰花环试验

将上述血小板悬浮液50 μL等分置于微量滴定孔中，加入（不搅拌）1.2 U/mL人凝血酶10 μL（终浓度为0.2 U/mL），静置15 min，再加入50 μL 2%多聚甲醛固定血小板，静置30 min，在凝血酶活化前加入0.5%DMSO、阿司匹林或薤白皂苷溶液50 μL。PBS洗涤胰蛋白酶3次并重悬于50 μL PBS中。然后向血小板悬浮液中加100 μL中性粒细胞，4 ℃摇摆孵育30 min。将携带2个或更多血小板的中性粒细胞定义为玫瑰花环。随即寻找不重复视野评价100个中性粒细胞。每个标本分3份进行测试，2个不同的观察者评估玫瑰花环百分比并取平均值[7]。

1.9 检测中性粒细胞上清液诱导的血小板聚集

将fMLP（2 μmol/L）加中性粒细胞悬液37 ℃孵育10 min，3000×g离心1 min，获得活化的中性粒细胞上清液。将洗涤的血小板与0.5%DMSO、阿司匹林或薤白皂苷溶液孵育10 min，37 ℃加入5 μL无活性的中性粒细胞上清液。按“1.6”项下方法测定。

1.10 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 薤白皂苷对体外血小板聚集的影响endprint

薤白皂苷呈浓度依赖性明显抑制AA诱导的血小板聚集，IC50为2.4 μmol/L。对ADP或PAF诱导的血小板聚集，薤白皂苷也有显著影响，IC50值分别为0.4、1.1 μmol/L；阿司匹林浓度依赖性地抑制AA诱导的血小板聚集（IC50为6.3 μmol/L），而不抑制ADP或PAF诱导的血小板聚集。结果见表1。

2.2 薤白皂苷对体内血小板聚集的影响

与生理盐水组比较，给药后60、120、180 min，薤白皂苷和阿司匹林对AA诱导血小板聚集均有明显的抑制作用，差异有统计学意义（P<0.01），薤白皂苷对ADP（给药后60、120、180 min）和PAF（给药后60、120 min）引起的血小板聚集有明显的抑制作用，差异有统计学意义（P<0.01），但阿司匹林对ADP和PAF引起的血小板聚集无明显影响。结果见表2。

2.3 薤白皂苷对血小板胞浆钙离子水平的影响

AA刺激生理盐水干预血小板内游离[Ca2+]i的Fluo-3荧光强度流式细胞仪检测结果见图1、图2，100 μmol/L薤白皂苷干预血小板[Ca2+]i的Fluo-3荧光强度流式细胞仪检测结果见图3、图4。薤白皂苷呈浓度依赖降低血小板内游离[Ca2+]i，20、100 μmol/L薤白皂苷干预血小板内游离[Ca2+]i浓度显著低于AA刺激生理盐水干预血小板内游离[Ca2+]i浓度（P<0.05）。结果见表3。

2.4 薤白皂苷对血小板和中性粒细胞间结合的影响

薤白皂苷抑制血小板和中性粒细胞结合的玫瑰花环率呈浓度依赖性，见表3。薤白皂苷和阿司匹林明显降低IC50，分别为2.7、25.6 μmol/L的血小板与中性粒细胞的结合。

2.5 薤白皂苷对活化中性粒细胞上清液诱导血小板聚集的影响

薤白皂苷显著抑制由fMLP激活的中性粒细胞诱导洗涤的血小板聚集，见表3。IC50为9.6 μmol/L，阿司匹林对fMLP激活的中性粒细胞诱导的血小板聚集无抑制作用。

3 讨论

薤白中皂苷类化合物通过抗血小板聚集、抗氧化、降血脂参与冠状动脉粥样硬化的整个过程。PAF、ADP和AA可引起血小板活化，并通过不同的途径导致血小板聚集[8]。本研究结果显示，薤白皂苷体外以浓度依赖方式抑制PAF、ADP和AA诱导的血小板聚集，给药后60、120 min，薤白皂苷和阿司匹林对AA诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用，薤白皂苷也分别在给药后60、120、180 min和60、120 min对ADP或PAF诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。有研究报道，血小板功能亢进与血栓形成障碍相关[9]。而本研究表明，薤白皂苷对血小板聚集的抑制是非特异性的，可能对血栓形成过程有多靶点的抑制作用。

血小板凝血酶活化后，血小板选择受体会迅速表达到细胞表面，并介导活化血小板与中性粒细胞的结合与黏附[10]。有研究报道，阿司匹林不抑制血小板選择受体的表达，而会明显抑制ADP刺激下的血小板释放致密颗粒[11]。本研究结果显示，阿司匹林可抑制血小板与中性粒细胞黏附，其机制可能为阿司匹林影响血小板表面其他黏附分子的继发表达，降低血小板与中性粒细胞黏附。本研究结果显示，薤白皂苷可显著抑制血小板与中性粒细胞的结合，其IC50与阿司匹林相当。研究发现，激活的血小板可增加中性粒细胞对外来信号的黏附，中性粒细胞聚集，溶酶体酶释放，血小板衍生产物能促进中性粒细胞趋化性、酶的释放和吞噬作用并抑制氧化爆发[12]。另一方面，血小板与中性粒细胞的黏附参与血栓调节过程，中性粒细胞衍生的产物可促进血小板聚集和血清素释放，血栓形成也是由血小板-中性粒细胞相互作用介导[13]。临床研究显示，血栓形成性疾病患者血小板新生莲花瓣数目明显增加[11]。本研究结果表明，薤白皂苷能明显抑制活化血小板与中性粒细胞结合的能力，可能有助于治疗血栓栓塞性疾病。

活化的中性粒细胞上清液含有大量生物活性物质，可影响血小板聚集、血栓形成和细胞内外Ca2+的运动[14]。本研究结果显示，阿司匹林对活化的中性粒细胞刺激的血小板聚集无影响，表明环氧合酶可能不直接参与中性粒细胞诱导的血小板聚集。有研究发现，毒性氧自由基、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶和PAF是中性粒细胞依赖性血小板激活的介质[10]。薤白皂苷对来自fMLP激活的中性粒细胞无细胞上清液诱导的血小板聚集呈浓度依赖性抑制，故薤白皂苷可能通过多个途径抑制血小板-嗜中性粒细胞相互作用。

血小板内[Ca2+]i的升高是血小板受外界不良刺激后受累范围的第二信使，在血小板形状发生变化、粘连、聚集时首先出现血小板内钙离子升高，[Ca2+]i又是血小板活化和血小板-中性粒细胞相互作用的重要介质[15]。本研究结果显示，AA诱导血小板内[Ca2+]i远高于正常水平，即血小板处于明显活化状态，薤白皂苷浓度依赖性地降低AA刺激的血小板[Ca2+]i。表明薤白皂苷抑制细胞外钙的流入和来自细胞外钙的流出。减少细胞溶质钙是薤白皂苷抑制血小板聚集和血小板和中性粒细胞间相互作用的机制之一。

综上，薤白皂苷体外和体内均可抑制血小板聚集，降低血小板-中性粒细胞黏附，并抑制活化的中性粒细胞诱导的血小板聚集。由于其抗血小板作用和抑制血小板-中性粒细胞相互作用，可能为开发血小板聚集类药物提供实验依据。

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（收稿日期：2017-07-11）

（修回日期：2017-07-25；编辑：华强）endprint