千佛菌含药血清对H22小鼠肝癌细胞增殖、凋亡的影响

胥 冰，张丽君，郭小兰，石小玲

（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

1 材料与方法

1.1 药品、试剂

药材为陕西镇安县千佛菌种植基地千佛菌；四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma）；二甲基亚枫（DMSO，Sigma）；RPMI1640培养液（Hyclone）；胎牛血清。

1.2 主要仪器

5%CO2培养箱（BindCD-150），超净工作台（苏州安泰），倒置荧光数码显微镜NikonTS-100F（DS-5MC），精密电子天平（德国赛多利斯股份公司），流式细胞仪（BD，美国），二氧化碳恒温细胞培养箱（BINDER C150）。

1.3 实验动物、瘤株

SD大鼠20只，体质量（250±5）g，购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2007-001。小鼠H22肝癌细胞株，我校免疫室赠予。

2 实验方法

2.1 含药血清的制备及灭活

大鼠适应性喂养一周后随机分为4组（n=4）：空白组；模型组；含药血清大、小剂量组。含药血清组，取500 g千佛菌加水大火煮沸转文火煎煮120 min，此法煎煮2次，合并两次滤液并浓缩至0.5 L相当于1 g/mL生药量为原液，以原液为大剂量即100%浓度；生理盐水倍比稀释后为小剂量即50%浓度2.5 g/（kg·次）灌胃给药，2次/d。空白组，给予同剂量生理盐水[3]。连续7 d，末次灌胃2 h后，麻醉，采血，无菌分离血清，56℃，30 min灭活处理，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱保存备用。

2.2 MTT法检测千佛菌含药血清对H22细胞增殖的影响

从液氮中取出H22细胞株复苏。用含10% FBS 的1640培养基在37℃含5%CO2的孵箱中培养，至对数生长期，将其制备成密度为3×106/mL细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μL。空白组加入1640培养液，含药血清大剂量组加入100 μL100%含药血清；含药血清小剂量组：加入100 μL100%含药血清，对照组：加入100 μL正常大鼠血清。每组设3个平行孔，培养24 h、48 h、72h后，每孔加入5 mg/mL的MTT10 μL，培养箱中继续培养4 h后，弃掉上清，每孔加入150 ul DMSO，振荡10 min，待结晶充分溶解，酶标仪490 nm处测定吸光度（A），计算抑制率。生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

2.3 流式细胞仪检测H22细胞凋亡

据MTT实验结果最终选定各组在48 h为最佳作用时间，将培养24 h的H22细胞，取两瓶，分别加入大小剂量含药血清，作用48 h，收集各组细胞，PBS洗涤2次，75%冰乙醇固定，避光加入碘化丙啶（PI）染液混匀30 min，流式细胞仪检测，计数10000个细胞，检测凋亡率，实验重复3次，取均值。

2.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 千佛菌含药血清对小鼠H22肝癌细胞增殖的影响

大、小剂量千佛菌含药血清均对H22肝癌细胞的增殖有抑制作用 ，但大剂量更为明显。抑制率呈明显的时间-剂量依赖性，充分说明千佛菌能够抑制肿瘤的增殖。

3.2 流式细胞仪检测小鼠H22肝癌细胞凋亡

将不同剂量千佛菌含药血清加入H22肝癌细胞培养48 h后，经流式细胞仪检测，千佛菌含药血清大、小剂量均能诱导H22肝癌细胞凋亡，而以大剂量组作用更显著。与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。

4 讨 论

千佛菌是一种药、食兼用的珍稀食用真菌。主要含多糖、维生素、蛋白质以及微量元素等，其主要活性成分及抗肿瘤成分为灰树花多糖，千佛菌具有“扶正固本”之功效。为祖国医学之扶正固本药，能增强机体的免疫力，改善症状，延长生存期，提高生活质量。本次实验，我们通过制备千佛菌大鼠含药血清，体外干预小鼠H22肝癌细胞24、48、72h发现均对H22肝癌细胞有一定的抑制增殖作用，且大剂量药效最好。

综上所述，本研究通过体外实验，验证了千佛菌含药血清对小鼠H22肝癌细胞增殖、凋亡的影响，证实了千佛菌对H22细胞有较好的抑制作用，为临床筛选抗肿瘤药物，尤其为开发天然的低毒或无毒药物提供了理论及实验依据，也为肿瘤疾病的临床治疗提供了新思路、新方法。