超高效液相色谱质谱联用法快速测定护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量

王 哲 王文波

(齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

工艺·试验

超高效液相色谱质谱联用法快速测定护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量

王 哲 王文波

(齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

采用超高效液相色谱质谱联用法，ESI离子源正离子模式选择离子扫描模式对护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙进行定量分析。五味子醇甲和五味子醇乙在一定范围内线性良好，相关系数均大于0.999，加样回收率为98.41%和96.91%(n=6)。该方法快速、灵敏度高、选择性好，适合测定护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的定量分析。

护肝片 五味子醇甲 五味子醇乙 超高效液相色谱质谱联用

护肝片是由柴胡、五味子、茵陈、板蓝根、绿豆和猪胆粉六味中药制成的中药制剂，具有疏肝理气，健胃消食的功能。具有降低转氨酶的作用，可用于慢性肝炎及早期肝硬化。方中的五味子有补肾宁心，收敛固涩的功能。对药品中五味子醇甲和五味子醇乙的测定，方法多以HPLC为主[1～3]，本实验创新采用超高效液相色谱质谱联用法同时测定了护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙含量，采用选择离子采集的模式，可以大大缩短测定时间，补充了护肝片含量测定方法，此方法简便，快捷，选择性好，结果准确，为有效控制产品质量提供了方法。

1仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱-质谱联用仪(美国沃特世公司ACQUITY超高效液相，Xevo G2 Q-TOF-MS质谱仪，Masslynx 4.1数据处理软件)；超声清洗仪KQ-500E(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore-Q型超纯水制备仪；Mettler AE240电子天平。

1.2 试药

五味子醇甲对照品(批号：161031)；五味子醇乙对照品(批号：160920)均购自上海融禾医药科技发展有限公司，实验用护肝片(鼎鹤牌)(批号：20160306、20160416、20160430)；乙腈为进口Fisher试剂，水为超纯机制水，其它试剂为分析纯。

2实验方法

2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取五味子醇甲和五味子醇乙对照品适量，加甲醇配制成每毫升含五味子醇甲0.300 0 mg、五味子醇乙0.100 0 mg的储备液。

2.2 供试品溶液的配制

取护肝片20片，除去包衣，研细，取0.2 g，精密称定，加乙酸乙酯8 mL，加热回流30 min，放冷过滤，用8 mL乙酸乙酯分次洗涤滤渣及容器，洗液与滤液合并，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备

根据药典护肝片的处方和制法，制出只含柴胡、茵陈、板蓝根、绿豆和猪胆粉，不含有五味子的阴性样品，再按上述方法制成阴性对照溶液。

2.4 色谱条件

色谱柱选用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm,1.7 μm)，流动相为梯度洗脱(A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液)：1-5 min，A-B(40∶60)；5-7 min，100%A；7-8 min，A-B (40∶60),流速0.3 mL/min，进样体积2 μL，柱温为30 ℃。

2.5 质谱条件

ESI源正离子模式，毛细管电压3.0 kV，脱溶剂气温度350 ℃，离子源温度100 ℃，脱溶剂气容量600 L·h-1，采样频率0.1 s，间隔0.014 s，选择离子采集模式，选择分子离子峰的质荷比分别为：五味子醇甲C24H32O7： [M+H-H2O]+(m/z415.212)，五味子醇乙C23H28O7：[M+H-H2O]+(m/z399.181)。

2.6 方法学考察

2.6.1线性关系

分别吸取对照品储备液50、100、150、200、250、300 μL定容至1.0 mL，按所设UPLC-MS条件进样2 μL，以相应的对照品的选择离子色谱图(见图1，图1用标准系列3的数据做的图，即五味子甲素为45 μg·mL-1五味子乙素为15 μg·mL-1)中的峰面积为纵坐标，相应的对照品质量浓度为横坐标进行直线回归，测定进样质量浓度与相应质谱峰面积的关系,求得它们的线性方程及相关系数。以最低检出限和定量限信噪比S/N=3和S/N=10为原则，分别计算五味子醇甲和五味子醇乙的LOD和LOQ的值。五味子醇甲和五味子醇乙的线性关系、相关系数和范围检出限与定量限见表1。结果表明，五味子醇甲和五味子醇乙的线性范围好，灵敏度高。

图1 五味子醇甲和五味子醇乙的选择离子流色谱图Fig 1 The SIR pictures of Schisandrin and Schisandrol B

2.6.2阴性实验

按前述的UPLC-MS条件进样阴性对照品溶液2 μL，在相同保留时间下的选择离子色谱图中未见相应五味子醇甲和五味子醇乙的峰。

2.6.3精密度与准确性

按前述的UPLC-MS条件对同一混合对照品重复测定6次，五味子醇甲和五味子醇乙的相对标准偏差(RSD，n=6)分别为1.27%和2.13%，说明本方法较为准确、可靠。

2.6.4重复性

取同一批护肝片样品6份，各约0.200 0 g，精密称定，制备供试品溶液，依UPLC-MS条件进行测定，测得护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙含量平均值分别为0.807 2和0.561 0 mg·g-1，相对标准偏差(RSD，n=6)分别为3.42%和2.07%，表明重复性良好，样品的选择离子色谱图见图2。

表1 五味子醇甲和五味子醇乙标准曲线测定、LOD和LOQ检测结果 .n=6Table 1 The results of linear regression，LOD and LOQ of Schisandrin and Schisandrol B.n=6

图2 护肝片样品的选择离子流色谱图(A、B分别为m/z415.212 和m/z399.181的选择离子流图)Fig 2 The SIR picture of Hugan Pian(A and B are the SIR of m/z415.212 and m/z399.181)

2.6.5稳定性实验

取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h按UPLC-MS条件进行测定。测得五味子醇甲和五味子醇乙的峰面积的RSD(n=8)分别为3.15%和3.73%，结果表明，供试品溶液在24h内基本稳定。

2.6.6加标回收率实验

精密称定已知含量的护肝片粉末0.200 0 g共6份,按所称量的五味子粉末中的五味子醇甲和五味子醇乙含量的80，100，120%添加对照品溶液，每种比例各配制2份，配制供试品溶液，按UPLC-MS条件进行测定。回收率结果见表2，结果表明，五味子醇甲和五味子醇乙回收率良好。

表2 加样回收率检测结果(n=6)Table 2 The result of recovery test of the investigated compounds(n=6)

2.7 样品含量测定

精密称量不同批次的护肝片粉末三份配制供试品溶液，依UPLC-MS条件测定，不同批次的护肝片五味子醇甲和五味子醇乙的含量见表3。

表3 不同批次护肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量 mg·g-1(n=3)Table 3 Contents of Schisandrin and Schisandrol B in Hugan Pian of three batches .mg·g-1(n=3)

3结 论

对色谱条件进行考察，包括乙腈-水和甲醇-水的不同配比和梯度洗脱，最终确定本实验色谱条件。该条件下的五味子醇甲和五味子醇乙色谱峰峰形好，相互之间无干扰，每针色谱条件仅需5 min即可完成，具有重现性好、灵敏度高、准确、快速等特点。

分别对不同批次的护肝片进行了五味子醇甲和五味子醇乙的含量比较，首次建立了以超高效液相色谱质谱联用选择离子模式法测定这两种木脂素的含量，为有效控制护肝片产品质量提供了方法。

[1] 倪琳，杨锡.HPLC法同时测定生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素[J].中成药，2012,34(5):872～875.

[2] 冯华，张超云等.HPLC法测定枣仁安神片中五味子醇甲的含量[J].中医药导报，2009,15(1)：82～83.

[3] 古海峰，张小茜等.HPLC法测定复方益肝灵片中五味子醇甲的含量[J].药物分析杂志，2009,29(2):295～297.

DeterminationofContentsofSchisandrinandSchisandrolBinHuganPianbyUPLC-ESI-Q-TOF-MS

Wang Zhe Wang Wenbo

(Institute of Chemistry and Chemistry Engineering, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006)

Schisandrin and Schisandrol B were determined by UPLC-ESI-Q-TOF-MS. The linear relationship between the concentration and peak areas of the Schisandrin and Schisandrol B were all linear(r>0.999).The average recoveries(n=6) were 98.41% and 96.91%.The method was rapid，sensitive，selective and suitable for the quantitative analysis of Schisandrin and Schisandrol B in Hugan Pian.

Hugan Pian Schisandrin Schisandrol B UPLC-ESI-Q-TOF-MS

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.05.003

2017-03-30

国家自然科学基金(81403067)；省自然科学基金(C2016059)。

王哲(1989～)，女，助理实验师，硕士，从事天然药物的研究，Email:zhew0316@163.com。