E3泛素连接酶对糖尿病冠状动脉大电导钙激活钾通道的调控及机制探讨∗

钱玲玲 刘晓宇 王如兴

目前，糖尿病对冠状动脉功能的影响及机制尚不完全清楚，可能与冠状动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾离子通道(large conductance calcium activated potassium channel，BK通道)异常有关[1－2]。糖尿病时BK通道表达降低与泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)对其泛素化降解增加有关，而这一过程受UPS中特异性的E3泛素连接酶调控。笔者在介绍UPS和糖尿病冠状动脉BK通道改变的基础上，重点阐述E3泛素连接酶对糖尿病冠状动脉BK通道的调控及其机制，以期为寻找糖尿病患者心血管疾病治疗的新靶点提供思路。

1 UPS

UPS是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与调节细胞内蛋白水平与功能[3]。UPS包括泛素、泛素酶、蛋白酶体及其底物蛋白等，其中泛素酶分为3大类:泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3[4]。E1起活化泛素的作用，E2与活化的泛素结合并将其转运到需要降解的底物蛋白质分子上，E3需要用其特异性的氨基酸序列和磷酸化结构域来识别靶蛋白，确保E2将泛素转运至底物蛋白结合，这样形成靶蛋白多聚泛素链，即泛素化。而后蛋白酶体系统可识别已泛素化的蛋白并将其降解[4]。至今发现的E1仅有唯一1种，E2有大于25种，E3有1 000多种。不同的底物蛋白泛素化过程依赖于特异性的E3，所以不同的泛素连接酶E3在不同疾病中的调控作用是研究的热点。

2 E3泛素连接酶对糖尿病冠状动脉BK通道的调控及其机制

BK通道是冠状动脉平滑肌细胞上存在的最主要的钾离子通道之一，对冠状动脉血管舒缩功能起重要的调控作用[5－9]。糖尿病时，BK通道不仅开放概率减少[10－11]，电压依赖性及钙离子依赖性受损[11－12]，且其电流密度及β1亚基蛋白表达显著降低[13－14]，导致糖尿病冠状动脉血管收缩增强，舒张减弱。近年来研究表明，糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK-β1亚基表达下降与泛素化调控密切相关。目前，已有文献报道与BK通道泛素化相关的E3连接酶包括F-box蛋白(FBXO)[15]、WNK4(with-no-lysinekinase-4)[16]、肌肉特异性环指蛋白1(MuRF1)[2]以及CRL4A(CRBN)[17]等。其中，WNK4可影响BK-α亚基的降解，过表达 WNK4可抑制BK-α亚基表达[16]。CRL4A(CRBN)失活可从内质网中释放去泛素化的BK通道至细胞膜，导致BK通道活性增强[17]。目前研究较多的是糖尿病时FBXO和MuRF1对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调控作用及其机制[2，15]。

2.1 FBXO蛋白对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调控及机制 FBXO是SCF(Skp1-Cullin-F-box)泛素连接酶复合体的重要组成部分，通常作为酶-底物的相互作用位点[18]。FBXO蛋白表达由F-box O家族转录因子FOXO调控，而FOXO的活性受蛋白激酶B(Akt)的负性调节。Akt可使FOXO磷酸化，磷酸化后的FOXO出细胞核，并丧失转录功能[19]。FBXO-9与FBXO-32是肌细胞中特异表达的FBXO亚型，在心肌细胞与骨骼肌细胞中大量表达[20－21]，其中FBXO-32可与底物蛋白的PDZ结合基序结合[20]，而BK-β1亚基上就存在这样的PDZ结合基序[15]。

在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠冠状动脉以及高糖培养的人冠状动脉平滑肌细胞中，BK通道电流密度降低，开放概率减少，BK-β1亚基蛋白表达下降，而BK-β1亚基蛋白泛素化水平明显增加，与此同时伴随FBXO-9与FBXO-32的蛋白表达明显增加[15]。采用小干扰RNA技术下调冠状动脉平滑肌细胞中FBXO-9的表达，可使BK-β1亚基蛋白表达增加1.65倍[15]。在FBXO的激动剂阿霉素孵育的细胞上，BK-β1亚基蛋白表达明显下降；在BK-β1亚基特异性的激动剂DHS-1作用后BK通道开放并不增加。而采用蛋白酶抑制剂MG-132同时处理可阻滞阿霉素引起的BK-β1亚基蛋白表达下降效应，表明FBXO确实参与调控BK-β1亚基蛋白表达[15]。转染人BK-β1亚基基因的 HEK293细胞，在FBXO和泛素共同处理后，BK-β1亚基泛素化水平明显增加；但转染PDZ结合基序突变的人BK-β1组，则BK-β1亚基泛素化水平变化不明显，证实BK-β1亚基中PDZ结合基序突变可阻止BK-β1亚基泛素化和蛋白降解[15]。糖尿病时FBXO的表达增加可能受FOXO-3a的磷酸化水平降低的影响，正常细胞在Akt抑制剂LY294002处理后，Akt和FOXO-3a的磷酸化水平减弱，而FBXO-32表达增加，BK-β1亚基蛋白减少，进一步证实FBXO途径对BK通道的调控可能与Akt磷酸化水平相关[15]。

在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠血管组织以及高糖培养的人冠状动脉平滑肌细胞中，BK-β1亚基蛋白减少，并伴随FBXO-32蛋白表达增加，FOXO-3a磷酸化水平降低，以及Akt磷酸化水平下降[22]。人冠状动脉平滑肌细胞予Akt抑制剂LY294002处理后，Akt磷酸化水平降低，FOXO-3a的磷酸化水平下降，FBXO-32蛋白表达增加，BK-β1亚基蛋白减少，这与高糖培养产生的效应一致[22]。糖尿病时FBXO的上调还可能与氧化应激关系密切，糖尿病可引起血管组织中蛋白激酶Cβ和氮氧化物表达增加，氧化应激水平升高[23]。过氧化氢刺激后冠状动脉平滑肌细胞FBXO-32蛋白表达增加，BK-β1亚基蛋白表达减少，证实糖尿病时氧化应激通过上调FBXO而引起BK-β1亚基蛋白表达减少[22]。高糖培养的细胞予蛋白激酶C抑制剂ruboxistaurin或过氧化物酶体增殖活化受体激动剂GW501516处理，可逆转高糖引起的Akt/FOXO-3a/FBXO-32信号通路效应，BK-β1亚基蛋白表达增加[22]。糖尿病小鼠予以ruboxistaurin或GW501516后与细胞实验结果一致，BK-β1亚基蛋白表达增加，BK通道功能增强，并且改善了受损的糖尿病小鼠血管舒张功能。

2.2 MuRF1蛋白对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调控及机制 肌肉特异性环指蛋白家族有3个成员，包括MuRF1、Mu RF2和MuRF3，是一组肌肉特异性的E3连接酶。这三种亚型均在心肌和骨骼肌组织中丰富表达，且都包含4种重要的结构域:一个环指结构域，一个MuRF家族的保守区域，一个“B-box”域和多个卷曲螺旋结构域[24]。Mu RF1已被证实参与调控多种心血管疾病，包括心肌肥厚、心肌缺血和心肌炎等[25]，近年来发现肌肉特异性环指蛋白参与血管功能调控[2]。

在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠血管组织中，BK通道开放减少，泛素化水平增加，BK-β1亚基蛋白表达下降，同时发现MuRF1蛋白水平增加[2]。采用小干扰RNA技术下调Mu RF1表达时，BK-β1亚基蛋白表达增加；而采用腺病毒转染过表达MuRF1时，BK-β1亚基蛋白表达降低。腺病毒转染MuRF1的冠状动脉对BK通道激活剂NS1619浓度依赖性舒张减弱，孵育蛋白酶体抑制剂MG132可使单纯过表达Mu RF1产生的效应恢复，证实 Mu RF1可通过泛素化调控BK-β1亚基表达[2]。后续实验研究也证实了BK-β1亚基的N末端可与Mu RF1的卷曲螺旋结构域相互作用。

糖尿病时 MuRF1的表达升高受核因子-κB和核因子E2相关因子2(Nrf2)激活的调控。Nrf2信号在维持细胞内氧化还原平衡发挥重要作用。在肾、心肌和血管平滑肌等细胞中，激活Nrf2可对抗高糖诱导的氧化应激介导的细胞凋亡，起到细胞保护作用[26]。在db/db糖尿病小鼠动脉组织内，BK-β1亚基蛋白表达下降，MuRF1蛋白水平增加，并且伴随Nrf2的表达减少，这与在人冠状动脉平滑肌细胞中下调Nrf2产生的效应一致；而腺病毒转染过表达Nrf2可使Mu RF1蛋白水平下降，BK-β1亚基蛋白表达增加[27]。这些结果证实糖尿病时Nrf2的减少可导致Mu RF1蛋白增加，从而BK-β1亚基降解增加。糖尿病小鼠予以Nrf2的激动剂富马酸二甲酯给药，可升高BK-β1亚基蛋白表达，并改善血管功能。在高脂饮食诱导的肥胖型糖尿病小鼠模型中也得到同样的结果[28]，并且 Nrf2可能是核因子-κB(NF-κB)的上游信号，腺病毒转染 Nrf2后，NF-κB/p50和 NF-κB/p65均表达降低。在体使用Nrf2的激动剂富马酸二甲酯可减少肥胖型糖尿病小鼠的体重和血糖值，促进BK-β1亚基的转录表达，减少受 MuRF1调控的BK-β1蛋白降解，从而对糖尿病冠状动脉舒张功能起保护作用。

3 结语

综上所述，糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞BK通道功能受损，BK-β1亚基蛋白表达减少，其原因可能与BK-β1亚基蛋白泛素化降解增加有关。FBXO和Mu RF1是目前已经证实的参与BK-β1亚基蛋白泛素化的两种肌肉特异性的E3连接酶。糖尿病时血管组织中氧化应激水平增加，Akt的磷酸化水平减降低，引起FOXO-3a的磷酸化水平降低，FBXO-32的蛋白表达增加，BK-β1亚基蛋白泛素化降解增加；同时也存在Nrf2表达减少，导致NF-κB激活降低，引起MuRF1蛋白水平增加，BK-β1亚基蛋白泛素化降解增加，表达减少，血管功能受损。干扰这些通路中的某些分子，如激活Akt或Nrf2，抑制BK通道泛素化，对糖尿病冠状动脉具有保护作用。因此，深入探讨糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞BK通道泛素化降解机制，可能为寻找糖尿病心血管疾病临床治疗的新靶点提供思路。