细胞外囊泡与自身免疫性疾病

赵 越 综述 刘志红 审校

·肾脏病基础·

细胞外囊泡与自身免疫性疾病

赵 越 综述 刘志红 审校

近年来，越来越多的研究证实细胞外囊泡(EVs)在免疫调控中发挥重要作用并且与自身免疫性疾病的发病机制密切相关。对于EVs的免疫调控相关机制的深入了解，有望为疾病预测及药物治疗提供有效靶点。本文将对EVs在免疫调控及自身免疫性疾病中的作用进行综述。

细胞外囊泡 免疫调控 自身免疫性疾病

细胞外囊泡(EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体。目前，EVs大致可分为3个主要类别：外泌体(exosomes)，细胞微泡(MVs)和凋亡小体。exosomes是最小的EVs，来源于细胞核内体的内出泡，聚集在多泡小体(MVBs)中，MVBs和细胞膜融合后以胞吐的方式被释放。MVs直径比exosomes略大，由细胞膜直接出泡形成。凋亡小体是在细胞凋亡过程中通过细胞膜直接出泡的方式被释放[1]。

EVs可通过运输蛋白质、脂质及核酸调控机体内细胞间的通讯，进而影响多种病理生理过程。由于EVs在免疫调节中的重要作用， 其与自身免疫疾病的发病机制及疾病进展密切相关。本文将概述EVs的免疫调控作用，尤其是对类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)等三种自身免疫性疾病的调控机制进行综述。

EVs与免疫调节

EVs内可包裹细胞核内分子，从而可能成为自身抗原的潜在来源，参与形成免疫复合物(ICs)[2]。抗原递呈细胞(APCs)能够通过MHC分子及共刺激分子，对抗原进行摄取、加工和递呈，在先天性免疫和适应性免疫反应之间传递信息。1996年，Raposo等[3]首次证实B细胞释放的EVs可携带MHC Ⅱ类分子，共刺激分子及黏附分子，提示这些微泡能够直接刺激CD4+T细胞。此后有研究发现，在MHC存在的情况下EVs能够激活自体反应性T细胞，从而在自身免疫反应中发挥重要的调控作用[2]。目前的研究认为自身免疫性疾病是在遗传因素作用下，感染和应激因子诱发异常的免疫反应所致。其中，病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)可通过活化APCs携带的模式识别受体(PRRs)促进APCs成熟，激活淋巴细胞并促使炎症因子产生。值得注意的是，表达PAMPs或DAMPs的EVs能够作为固有免疫反应的辅助剂发挥调控作用。EVs能够携带并分泌与炎症反应相关的多种分子，如白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)等，从而介导免疫反应的发生[4]。

EV与自身免疫性疾病

类风湿性关节炎(RA) RA是一种自身免疫性疾病，临床表现为关节疼痛、畸形及多系统损害。RA患者的重要病理特征是关节滑液中含有促炎性ICs，主要由关节滑液中的MVs与抗瓜氨酸化的自身抗体结合形成。瓜氨酸化是一种翻译后修饰过程，肽酰精氨酸在肽酰精氨酸脱亚基酶(PAD)的作用下被转化为瓜氨酸。RA患者关节滑液中富含2、4亚型PAD，可将MVs表面的蛋白瓜氨酸化，形成新抗原(波形蛋白，纤维蛋白等)[5]。抗瓜氨酸的自身抗体绑定MVs后，吞噬细胞可通过Fc受体(FcR)和补体受体(CR)识别它们，从而促进MVs形成微粒-免疫复合物(MP-ICs)。体外实验证实，这些MP-ICs能够诱导中性粒细胞释放白三烯，促进炎症反应[6]。

研究表明，参与形成MP-ICs的MVs多数表达CD41，提示来源于血小板[7]。2002年，Knijff-Dutmer等[8]首次证实血小板来源的EVs(PMVs)与RA发病密切相关。与正常对照相比，RA患者血浆中能够检测到更多的PMVs，并且PMVs数量与疾病严重程度相关。另一项研究中，Boilard 等[9]构建了炎性关节炎小鼠模型，去除该模型的血小板能够明显缓解其关节病变，提示PMVs与炎症性关节炎病理损伤相关；体外实验敲除血小板细胞表面的糖蛋白(GPVI)后，将其与滑膜成纤维细胞(FLS)共培养可下调PMVs水平。该研究表明，PMVs的产生是由胶原绑定至血小板表面的GPVI，激活血小板相关信号通路所致。

尽管很多研究证实PMVs是血液中丰度最高的MVs，并且是关节滑液中MVs的主要来源，其他细胞来源的MVs同样参与了RA的病理过程。RA患者关节滑液中T细胞和单核细胞来源的MVs能够活化FLS内多条信号通路，包括NF-κB、激活蛋白1(AP-1)、P38激酶及c-Jun N端激酶(JNK)通路[10]。FLS被激活后，可上调环氧酶2和前列腺素E合酶，从而诱发基质金属蛋白酶(MMPs)的释放，上调促血管生成因子的产生[11]。由此可见，RA患者关节滑液中的MVs能够通过活化FLS在炎症反应及局部关节损害中发挥重要作用。

近年来，长链非编码RNA(lncRNAs)相关研究备受关注，lncRNAs在多种疾病中均发挥重要调控作用。Hotair(HOX transcript antisense RNA) 是第一个被发现的lncRNA，具有反转录活性。RA患者血清exosomes中的Hotair水平明显升高，并可导致活化的巨噬细胞迁移率增加。分化的破骨细胞及滑膜细胞中Hotair表达显著下降，而给予外源性Hotair能够下调MMP-2和MMP-13水平。上述证据表明，exosomes来源的Hotair有望成为诊断RA的潜在分子标志物[12]。目前RA的治疗主要是基于炎症因子的靶向治疗，虽然能够缓解RA的临床症状，但并不能逆转其疾病进程。最近有研究报道，由免疫抑制基因修饰的骨髓来源的DCs能够抑制炎症和胶原诱导的关节炎。对不成熟DCs分泌的exosomes给予细胞因子(如IL-4，IL-10)刺激能够明显缓解胶原诱导的关节炎小鼠模型的疾病严重程度[13]。纯化DCs分泌的exosomes非常稳定，因此有望成为治疗RA的潜在工具。

系统性红斑狼疮(SLE) SLE是一类自身免疫性疾病，主要由遗传因素与环境因素相互作用所致，其临床特征为多器官受损。SLE发病的标志为自身抗体的产生，主要为抗核抗体(ANA)。血清中的ANA能够与染色质组分，包括双链DNA(ds-DNA)、核小体、核糖核蛋白和RNA等结合形成ICs，沉积在多种组织器官中导致补体激活，最终诱发急性或慢性炎症[14]。研究发现，与正常对照组相比，SLE患者PMVs数量更高[15]，与RA相关研究不同的是，尚未发现PMVs与SLE疾病严重程度相关。

值得一提的是，SLE患者循环中的EVs数量和构成都与健康对照人群及其他自身免疫性疾病患者不同，来源于SLE患者的EVs具有较为特异的蛋白表达谱，组学分析显示，与健康对照及RA患者相比，SLE患者循环中的EVs包含更多的免疫球蛋白，主要为IgG、IgA、IgM和补体蛋白(C1q，C1s，C3，C4b和C9)[16]等。该现象与SLE患者的病理特征密切相关，即导致凋亡小体的清除障碍。细胞凋亡是一种基本生物学现象，是由基因控制的细胞自主的程序性死亡，在维持机体内环境稳定中起着重要的作用。细胞凋亡过程中可发生分子重排，细胞膜出泡形成凋亡小体[17]。Radic等[18]观察到，凋亡小体中包含DNA、RNA、组蛋白、组蛋白-DNA复合物及核小体核心微粒。正常生理状况下， 凋亡小体形成后迅速被细胞外环境中的吞噬细胞清除，从而阻止了促炎因子的释放，避免发生炎症反应。而在病理状况下，如SLE患者存在凋亡调节异常及吞噬功能损害，导致细胞凋亡组分的清除障碍。由于凋亡细胞产生的凋亡小体内装载细胞核内分子，成为SLE自身抗原的潜在来源，患者血浆中的自身抗体能够与凋亡小体相结合，凋亡小体不断累积可持续刺激自体反应性细胞，最终导致自体免疫耐受被打破从而发生自身免疫反应(图1)[7]。

图1 免疫细胞凋亡程序调控异常与SLE多器官损害[7]MP-ICs:微粒-免疫复合物；SLE：系统性红斑狼疮

SLE患者细胞凋亡过程异常，凋亡细胞释放的细胞外微粒成为循环中自身抗原的主要来源，与自身抗体结合形成MP-ICs，从而导致机体炎性免疫反应的持续并最终诱发多器官损害。

肾脏是SLE最常见的受累器官之一，SLE累及肾脏可导致狼疮性肾炎(LN)。LN是SLE死亡率增加的主要原因，10%～30%的患者可进展为终末期肾病(ESRD)[19]。肾活检是目前预测肾脏疾病预后的重要标准，但探索新的无创生物标志物将有助于实时监控肾脏疾病进展。由于尿液的收集方法简便、无创，因此，能够成为较理想的生物标志物。Pisitkun等[20]在2004年首次鉴定出尿液exosomes，此后，人们开始关注尿液exosomes作为预测及诊断泌尿系统及全身疾病的生物标志物的潜在价值。随着研究的不断深入，EVs相关的miRNAs及小编码RNA均已被证实可以作为SLE肾脏损伤的生物标志物。Ichii等[21]研究证实，LN患者exosomes中miR-26a水平的上调与其尿蛋白水平呈正相关，有望成为预测足细胞损伤的分子标志物。Solé等[22]报道，与正常对照相比，LN患者尿液exosomes中miR-29c水平下调，其水平与肾功能及肾脏纤维化程度相关，提示exosomes也可作为预测肾组织纤维化的有效指标。

ANCA相关性血管炎(AAV) AAV包括肉芽肿性血管炎，微型多血管炎(MPA)和变应性肉芽肿性血管炎(CSS)[23-24]。这三种疾病临床表现、治疗和预后相似，且多数患者ANCA阳性，因此也叫做AAV。AAV以肾脏和肺部损害为主要临床表现，其基本病理改变为坏死性小血管炎[25]。ANCA能够直接结合中性粒细胞胞质内抗原，主要为蛋白酶3(PR3)和髓过氧化物酶(MPO)，导致中性粒细胞功能失调并释放大量的细胞毒素调节因子，进而诱发内皮损伤及血管炎[26]。近年来研究表明，AAV患者循环中增多的MVs主要来源于血小板和中性粒细胞。此外，活动性AAV患者PMVs和中性粒细胞分泌的MVs(NMVs)均高于间断发作的AAV患者，并且与AAV活性评分密切相关[27-28]。该研究提示，NMVs有望成为预估AAVs疾病活性的分子标志物。

不仅如此， 由于MVs可携带多种来源于供体细胞的生物活性分子，因此能够参与炎症反应及血栓形成相关通路的调节，在急性血管炎症的病理进程中发挥重要作用。Hong等[29]研究表明， AAV自身抗原PR3和MPO在活性AAV儿童患者的血浆中表达上调并随疾病活动程度而发生变化。该研究通体外实验证实，来源于AAV患者的PR3-ANCA和MPO-ANCA能够活化中性粒细胞，刺激NMVs产生，这些NMVs通过CD18介导的途径绑定至内皮细胞，上调细胞间黏附分子(ICAM-1)的水平，诱导内皮细胞产生活性氧簇(ROS)，从而诱发内皮细胞释放炎性因子IL-6和IL-8。若通过滤过的方式去除NMVs，则可阻断NMVs所致的内皮细胞活化。以上研究均提示，在AAV的血浆置换疗法中，NMVs可能作为重要的治疗靶点，聚焦NMVs的研究具有潜在的临床转化价值。

AVV患者的静脉血栓栓塞发病率与系统炎症反应呈显著相关[30]，而AAV患者的血栓形成发生率又与其疾病活动性相关[31]。现已明确，组织因子(TF)是生理性凝血反应及病理性静脉血栓形成的重要启动因子。TF能够与凝血因子Ⅶ结合形成复合物，催化蛋白酶因子X的活化以及凝血酶的产生。Daniel等[27]发现高表达TF的MVs与儿童患者凝血酶产生相关，这群高表达TF的MVs来源于中性粒细胞，且与疾病活动性关系密切。通过机制研究，Plustoka等[32]发现中性粒细胞活化后释放的NMVs中整合素αMβ2(CD11b/18)表达上调，CD11b/18与血小板上的受体GPIbα发生相互作用，从而激活血栓形成相关通路。以上结果提示NMVs能够刺激凝血酶产生，进而参与AAV相关的血管损害。

结语:自身免疫性疾病是一类严重危害人类健康的疾病，其发病机制尚待进一步研究阐明。EVs的供体细胞来源广泛，其内部含有丰富的生物信息，是介导细胞-细胞间及细胞-组织间通讯及调控的重要途径之一。随着EVs在自身免疫疾病中的机制研究日益深入，相关技术的不断进步，相信在不久的将来，有能够运用EVs的生物学特性及其调控功能，为临床诊断与治疗提供新的策略。

1 Akers JC,Gonda D,Kim R,et al.Biogenesis of extracellular vesicles (EV):exosomes,microvesicles,retrovirus-like vesicles,and apoptotic bodies.J Neurooncol,2013,113(1):1-11.

2 Buzas EI,György B,Nagy G,et al.Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.Nat Rev Rheumatol,2014,10(6):356-364.

3 Raposo G,Nijman HW,Stoorvogel W,et al.B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.J Exp Med,1996,183(3):1161-1172.

4 Zhang HG,Liu C,Su K,et al.A membrane form of TNF-alpha presented by exosomes delays T cell activation-induced cell death.J Immunol,2006,176(12):7385-7393.

5 Foulquier C,Sebbag M,Clavel C,et al.Peptidyl arginine deiminase type 2 (PAD-2) and PAD-4 but not PAD-1,PAD-3,and PAD-6 are expressed in rheumatoid arthritis synovium in close association with tissue inflammation.Arthritis Rheum,2007,56(11):3541-3553.

6 Cloutier N,Tan S,Boudreau LH,et al.The exposure of autoantigens by microparticles underlies the formation of potent inflammatory components:the microparticle-associated immune complexes.EMBO Mol Med,2013,5(2):235-249.

7 Burbano C,Rojas M,Vásquez G,et al.Microparticles That Form Immune Complexes as Modulatory Structures in Autoimmune Responses.Mediators Inflamm,2015,2015:267590.

8 Knijff-Dutmer EA,Koerts J,Nieuwland R,et al.Elevated levels of platelet microparticles are associated with disease activity in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,2002,46(6):1498-1503.

9 Boilard E,Nigrovic PA,Larabee K,et al.Platelets amplify inflammation in arthritis via collagen-dependent microparticle production.Science,2010,327(5965):580-583.

10 Jüngel A,Distler O,Schulze-Horsel U,et al.Microparticles stimulate the synthesis of prostaglandin E(2) via induction of cyclooxygenase 2 and microsomal prostaglandin E synthase 1.Arthritis Rheum,2007,56(11):3564-3574.

11 Reich N,Beyer C,Gelse K,et al.Microparticles stimulate angiogenesis by inducing ELR(+) CXC-chemokines in synovial fibroblasts.J Cell Mol Med,2011,15(4):756-762.

12 Song J,Kim D,Han J,et al.PBMC and exosome-derived Hotair is a critical regulator and potent marker for rheumatoid arthritis.Clin Exp Med,2015,15(1):121-126.

13 Cai Z,Zhang W,Yang F,et al.Immunosuppressive exosomes from TGF-β1 gene-modified dendritic cells attenuate Th17-mediated inflammatory autoimmune disease by inducing regulatory T cells.Cell Res,2012,22(3):607-610.

14 Tsokos GC.Systemic lupus erythematosus.N Engl J Med,2011,365(22):2110-2121.

15 Sellam J,Proulle V,Jüngel A,et al.Increased levels of circulating microparticles in primary Sjögren′s syndrome,systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis and relation with disease activity.Arthritis Res Ther,2009,11(5):R156.

16 Østergaard O,Nielsen CT,Iversen LV,et al.Unique protein signature of circulating microparticles in systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,2013,65(10):2680-2690.

17 Halicka HD,Bedner E,Darzynkiewicz Z.Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in apoptotic bodies during apoptosis.Exp Cell Res,2000,260(2):248-256.

18 Radic M,Marion T,Monestier M.Nucleosomes are exposed at the cell surface in apoptosis.J Immunol,2004,172(11):6692-6700.

19 Ortega LM,Schultz DR,Lenz O,et al.Review:Lupus nephritis:pathologic features,epidemiology and a guide to therapeutic decisions.Lupus,2010,19(5):557-574.

20 Pisitkun T,Shen RF,Knepper MA.Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(36):13368-13373.

21 Ichii O,Otsuka-Kanazawa S,Horino T,et al.Decreased miR-26a expression correlates with the progression of podocyte injury in autoimmune glomerulonephritis.PLoS One,2014,9(10):e110383.

22 Solé C,Cortés-Hernández J,Felip ML,et al.miR-29c in urinary exosomes as predictor of early renal fibrosis in lupus nephritis.Nephrol Dial Transplant,2015,30(9):1488-1496.

23 Brogan P,Eleftheriou D,Dillon M.Small vessel vasculitis.Pediatr Nephrol,2010,25(6):1025-1035.

24 Ntatsaki E,Watts RA,Scott DG.Epidemiology of ANCA-associated vasculitis.Rheum Dis Clin North Am,2010,36(3):447-461.

25 Jennette JC,Falk RJ,Hu P,et al.Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.Annu Rev Pathol,2013,8:139-160.

26 Haubitz M,Dhaygude A,Woywodt A.Mechanisms and markers of vascular damage in ANCA-associated vasculitis.Autoimmunity,2009,42(7):605-614.

27 Daniel L,Fakhouri F,Joly D,et al.Increase of circulating neutrophil and platelet microparticles during acute vasculitis and hemodialysis.Kidney Int,2006,69(8):1416-1423.

28 Erdbruegger U,Grossheim M,Hertel B,et al.Diagnostic role of endothelial microparticles in vasculitis.Rheumatology (Oxford),2008,47(12):1820-1825.

29 Hong Y,Eleftheriou D,Hussain AA,et al.Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies stimulate release of neutrophil microparticles.J Am Soc Nephrol,2012,23(1):49-62.

30 Allenbach Y,Seror R,Pagnoux C,et al.High frequency of venous thromboembolic events in Churg-Strauss syndrome,Wegener′s granulomatosis and microscopic polyangiitis but not polyarteritis nodosa:a systematic retrospective study on 1130 patients.Ann Rheum Dis,2009,68(4):564-567.

31 Stassen PM,Derks RP,Kallenberg CG,et al.Venous thromboembolism in ANCA-associated vasculitis--incidence and risk factors.Rheumatology (Oxford),2008,47(4):530-534.

32 Pluskota E,Woody NM,Szpak D,et al.Expression,activation,and function of integrin alphaMbeta2 (Mac-1) on neutrophil-derived microparticles.Blood,2008,112(6):2327-2335.

Extracellularvesiclesandautoimmunediseases

ZHAOYue,LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases，JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210016，China

Recently, emerging evidences showed that extracellular vesicles (EVs) plays a vital role in immune regulation and the pathogenesis of autoimmune diseases. A deep understanding of the biological characteristics and the molecular mechanism of EVs may provide effective targets for disease prediction and treatment. In this review, we focused on the biological characteristics of EVs and its role in immune regulation as well as autoimmune diseases.

extracellular vesicles immune regulation autoimmune diseases

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.06.013

国家自然科学基金重大研究计划(91442104)，国家自然科学基金青年基金(81600559)，南京军区总院院管课题(2016035)

南京总医院 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2017-06-12

(本文编辑 加 则 青 松)