HRT对餐厨垃圾与秸秆混合高温厌氧发酵的影响

乔 玮,尹冬敏,刘月玲,毕少杰,王 菁,董仁杰 (中国农业大学工学院,生物质工程中心,国家能源生物燃气高效制备及综合利用技术研发(实验)中心,北京 100083)

对于全混式厌氧发酵反应器而言,水力停留时间(HRT)和容积负荷直接影响着厌氧发酵系统的容积甲烷产率.如果 HRT过长,就会在一定程度上使得厌氧发酵系统的运行成本增加;但是如果水力停留时间过短,单位时间内流出反应器的菌体增加,进而造成反应器微生物含量降低,有机物还没有被降解完全就流出反应器.Lgoni[1]指出,不同类型的微生物菌群代谢最短至 30min;各种产乙酸菌的最短世代更替周期1.5～ 4.0d;然而两类主要的产甲烷菌世代周期差异较大,嗜乙酸产甲烷菌的最短世代周期为2～3d,而嗜氢产甲烷菌的繁衍速度很快,世代周期最短仅需 6h.同时,过高的有机负荷可能会使得系统不稳定,造成挥发性有机酸的累积,影响系统的酸碱平衡,进而影响微生物的代谢能力.有机负荷过低,发酵系统中的微生物则处于低效运行状态,使得运行成本增加,综合经济效益较差[2-3].因此,选取合适的 HRT和有机负荷对于甲烷发酵过程至关重要.

餐厨垃圾是一种非常典型的有机废物,我国每年产生餐厨垃圾约6000万t[4].将餐厨垃圾和秸秆混合发酵能够在原料特性上调节C/N比,在发酵动力学上调节产酸和产甲烷速率的匹配,使发酵过程更稳定.因此,本文以餐厨垃圾和秸秆为共混原料,逐级稀释进料浓度并梯度缩短HRT,分析产气量,降解率,pH值和挥发性有机酸等指标的变化规律,获得高温发酵微生物洗出的极限HRT;进一步分析随着HRT的缩短,产甲烷古菌和酸化细菌的组成与变化规律,探索混合原料高温发酵的产甲烷路径,为厌氧发酵工艺设计提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理方法

表1 混合原料和接种污泥的基本性质Table 1 Characteristics of materials and inoculums for CSTR

餐厨垃圾取自中国农业大学学生餐厅的午餐剩余物,去除大块杂质(如骨头,果核,纸巾,塑料袋和一次性餐具等),用豆浆机(Joyoung-JYLC012)进行 5min的高速破碎,粉碎至浆状后储存在 4℃冰箱中备用.玉米秸秆取自北京郊区密云县石匣村秸秆沼气站,为晒干后初步粉碎的玉米秸秆.先用小型粉碎机(HC-1000Y2)粉碎,过40目筛,备用.

混合发酵原料为餐厨垃圾和秸秆按照总干物质(TS)比为1：1配比混合,水稀释至 TS为 8%左右;高温接种污泥取自北京密云石匣村秸秆沼气站的高温厌氧消化污泥,该沼气站常年运行,实际温度控制在 50～60℃.混合原料和接种污泥的理化性质如表1所示：

1.2 试验装置与运行条件

图1 厌氧发酵实验装置Fig.1 Scheme of experimental device

表2 实验运行方案Table 2 The summary of experimental digester operation

实验装置示意图如图1所示,主要包括基质贮藏装置和发酵装置两部分,总容积均为2.5L,工作容积为 2.0L.循环水浴锅(HH-60)控制温度,分别维持在(4±1)℃和(55±3)℃.搅拌器与自动计时器相连,每 2h搅拌 10min,转速约为 50～90r/min.湿式流量计(LML-1)记录发酵罐的日产气量.

在探究得到高温混合发酵系统所能承受的最大有机负荷(OLR)[10gVS/(L⋅d)]基础上,逐级缩短 HRT,并不断降低进料浓度,以保证体系负荷不能超过最大承载负荷.具体实验运行方案见表2.

1.3 常规指标测试方法

TS,VS,SS和 VSS采用美国水和废水监测标准方法测定[5];pH值采用玻璃电极(Orion 5-Star pH)测定;COD采用重铬酸钾法测定[6];氨氮浓度采用水杨酸-次氯酸盐分光光度法测定[7];总碱度和碳酸氢盐碱度用滴定法测定(以碳酸钙计),采用0.1mol/L的稀盐酸滴定发酵液上清液pH值至5.4和4.8,分别用以计算碳酸氢盐碱度和总碱度[8];发酵液中的挥发性脂肪酸(VFA)用GC-2010Plus气相色谱法测定,测试条件为：载气(氮气)分压 0.4MPa,氢空一体机气流速度 20～30mL/min,进样口,柱温,检测器(FID)温度分别为 230,60,250℃,进样体积 10μL;沼气成分(CH4和CO2)采用GC SP2100气相色谱仪测定,色谱柱为Ф10m×2mm不锈钢色谱柱,测试条件为：载气(氢气)分压 0.4MPa,流速 60mL/min,进样口,色谱柱,检测器(TCD)的温度分别为130,130,116℃;沼气体积通过湿式流量计(LML-1)测定.

1.4 细菌与古菌分析方法

分别取反应器不同HRT稳定期的料液进行高通量测试.CTAB标准方法对样本的基因组DNA 进行提取,然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度,无菌水稀释至1ng/mL,即为PCR扩增模板.16S V4 区引物为515F-806R,18S V4 区引物为 528F-706R,18S V9 区引物为1380F-1510R,ITS1 区引物为 ITS5-1737F,ITS2-2043R,ITS2区引物为 ITS3-2024F,ITS4-2409R.酶和缓冲溶液采用 New England Biolabs公司 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer.采用 PCR 仪(Bio-rad T100 梯度PCR 仪)进行扩增,扩增程序包括一个预变性步骤(98 ℃,1min),30个循环(每个循环包括 98℃,10s;50 ℃, 30s;72 ℃ , 30s),72 ℃ , 5min.产物用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测.等浓度混样,充分混匀后用 1×TAE 2%的琼脂糖胶电泳纯化 PCR产物,选择主带大小400～450bp之间的序列,割胶回收目标条带.产物纯化试剂盒为 Thermo Scientific 公司 GeneJET 胶回收试剂盒.使用New England Biolabs 公 司 的 NEB Next®Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库经过 Qubit 定量和文库检测,合格后,使用HiSeq上机测序.基于有效数据进行 OTUs聚类和物种分类分析.为避免偏差,所有样品进行3个重复.

1.5 数据分析

所有试验均为 3组平行测试,表中所列数据为平均值±标准差.采用单向方差分析(one-way analysis of variance (ANOVA))对同组数据进行分析,置信度水平为 0.95.数据分析软件为Excel2016和Origin8.0.

2 结果与讨论

2.1 HRT对反应器性能的影响

甲烷产量是评价一个厌氧消化体系运行性能好坏最关键和最直观的指标,物料单位 VS产气率越高,说明物料的降解效果越好;反应器容积产甲烷率与整个厌氧消化工程的经济效益密切相关,反应器容积产甲烷率越高,说明在相同运行成本下,综合经济效益越高.图2(a)显示,CSTR系统在55d的高温连续发酵过程中,HRT依次递减为 5,3,1.5,1,0.5d,对应 OLR依次为 8.0,6.66,6.66(3.33),5.0,5.0gVS/(L⋅d).随着 HRT 逐级递减,沼气容积产气率和甲烷浓度都呈逐渐降低的趋势[图2(b)].当 HRT 为 5d,OLR 为 8.0gVS/(L⋅d)时,甲烷浓度稳定在 65.5%左右,此时系统能够稳定的运行.在本阶段的实验中,系统运行了4个HRT,反应器的沼气产量在10～20d期间是平稳的,约为4.5L/(L⋅d).当HRT缩短为3d时,甲烷浓度略有下降,从 69.2%下降到 63.2%,容积产气率出现明显下降,从 4.31L/(L⋅d)下降到 1.23L/(L⋅d);当 HRT 继续缩短为1.5d,有机负荷降为3.33gVS/(L⋅d)时,容积产气率仅为0.41L/(L⋅d),pH值,TS和VS的去除率都维持在正常的水平,该阶段反应器仍能平稳运行.直到 HRT缩短为 0.5d,OLR为 5.0gVS/(L⋅d)时,反应体系容积产气率几乎为0,甲烷浓度急剧下降,但反应器的 pH值却没有明显下降,说明反应器产气的下降不是酸积累造成的.此阶段现象表明HRT太短,厌氧微生物已经随着出料流失,使得甲烷发酵终止.

图2 餐厨垃圾与秸秆混合连续发酵的系统性能Fig.2 Performance of co-fermentation of kitchen waste and straw

在厌氧发酵连续实验过程中,有机酸的累积表明产酸速率和有机酸分解速率之间的不平衡,反映了产酸菌群和产甲烷菌群的解偶联作用[9],挥发性有机酸代谢平衡是厌氧发酵反应器稳定运行的关键.如图2(c)所示,pH 值一直稳定在 7.2左右,表明发酵系统酸碱平衡处于相对稳定状态,当HRT为5d(OLR为8.0gVS/(L⋅d))和3d(OLR为6.66gVS/(L⋅d))时,总酸(TVFA)浓度分别由 570 和1060mg/L升高到1380和2230mg/L,其中HRT 5d时乙酸浓度变化不大,稳定在 310mg/L左右,而丙酸浓度则从190mg/L累积达到1062mg/L,所以丙酸累积是该段有机酸浓度升高的主要原因.此阶段有机负荷较高,系统对酸的缓冲能力下降,间接影响了产酸菌的代谢活性,增加了高分子量 VFA的生成;而 HRT 3d时丙酸浓度较前一阶段降低,浓度稳定在 300mg/L左右,但是这一阶段乙酸浓度由530mg/L逐渐累积达到1870mg/L,所以此阶段有机酸浓度的升高主要是由乙酸累积导致的.可见随着进料浓度的降低,丙酸浓度下降,而乙酸浓度升高,说明进料浓度降低时,丙酸在高温条件下可被产酸菌分解利用产生乙酸.HRT为1.5,1.0d时,乙酸浓度仍保持较高水平,平均值最高达到2200mg/L,而丙酸浓度较低,在100～250mg/L之间浮动,由此阶段挥发性有机酸的分布情况可以看出多种酸的存在,表明反应系统进行的是混合型发酵.总之HRT从5.0d逐级递减为1.0d的各阶段,发酵系统都能够平稳运行至少 4个 HRT,表明高温条件下的混合发酵系统能耐受更高浓度的有机酸.但是当HRT缩短到0.5d时,由于HRT过短,反应体系已经不再产气,表明此阶段的微生物停留时间(同HRT)不足以维持微生物的生长代谢平衡,微生物被洗出反应器.李蕾等[10]研究表明,高负荷[6gVS/(L⋅d)]条件下,产酸细菌(柔膜菌门、放线菌门)大量增殖,诱导互养脂肪酸降解菌(梭菌纲)丰度剧增,而与之互营的氢型产甲烷菌的丰度和活性却下降了.产甲烷菌与互养脂肪酸降解菌的失衡导致它们不能有效的互养合作,从而引起挥发性脂肪酸(VFA)积累和过程失稳.

2.2 HRT对丙酸/乙酸的影响

丙酸/乙酸值的大小是反应发酵系统稳定性的一个重要指标.有研究报道,当丙酸/乙酸值超过 1.4,且乙酸浓度高于 800mg/L时,厌氧发酵系统就会发生酸败[11-14].

从图3可以看出,HRT为5d时,丙酸/乙酸值较高,最高可达 4.6左右,但是此阶段乙酸浓度较低,低于800mg/L,而HRT从3d递减为0.5d的过程中,乙酸和 TVFA浓度最高达 3000和3500mg/L,但是丙酸/乙酸值均低于 0.8,也从另一个角度说明整个发酵系统是相对稳定的,未发生酸败现象.因此,当HRT为0.5d时,系统产气停止不是系统酸败引起的,而是由于微生物被洗出引起的发酵失败,所以 HRT 0.5d为混合原料(餐厨垃圾和玉米秸秆)高温连续发酵微生物洗出的极限HRT.

图3 停留时间对乙酸和丙酸浓度的影响Fig.3 Effect of HRT on the acetic and propionic

2.3 HRT对TS和VS去除率的影响

TS体现的是总有机物质和无机物质的总和,VS是产甲烷的主要来源.TS和VS去除率反映的是厌氧发酵系统中混合物料的利用率情况,TS和VS去除率的大小也间接反映了厌氧消化系统中水解产酸菌和产甲烷菌的代谢能力和系统的运行稳定性.图4为停留时间对TS和VS去除率的影响,从图2(d)和2(c)及图4可以看出,当HRT由5d逐渐缩短到1.5d[OLR为6.66gVS/(L⋅d)]时,TS和VS去除率都逐渐降低,表明HRT太短时,微生物冲刷流失,微生物数量的减少直接影响发酵底物的利用率;当 HRT仍为 1.5d,但是将进料浓度减半后发现,TS和VS去除率有所提高,比降低进料浓度前分别提高80%和20%,这是因为在微生物数量差别不大的前提下,负荷越低,原料降解越充分.同时,从图中发现,当 HRT降到0.5d时,TS和 VS去除率急剧下降为 5.17%和5.77%,此时反应体系已经不再产气,表明微生物已经被大量洗出,此时的 HRT(0.5d)就是微生物洗出的界限HRT.

Harrison等[15]论证了处理初沉池中污泥停留时间,在标准中温消化 35℃条件下,不发生冲刷流失的HRT界限为4.2d,而本研究结果为55℃高温条件下的界限HRT,在设计时还需考虑HRT的安全率,McCarty[16]推荐最小安全率为2.5,因此,计算得到35℃条件下最小设计HRT为10d,和多数研究者是一致的.本研究结果表明55℃高温条件下最小设计HRT为1.25d.所以中温甲烷发酵HRT多设计为 20～30d,而高温甲烷发酵多为10～15d[17].

图4 停留时间对TS和VS去除率的影响Fig.4 Effect of HRT on the TS and VS removal

2.4 HRT对菌落结构的影响

2.4.1 细菌群落结构特征的变化 图5高通量测序结果显示,餐厨垃圾和秸秆高温沼气发酵液中目水平(Order)的优势菌群均属于Firmicutes门和Thermotogae门.Firmicutes门是厌氧反应器中主要的水解酸化菌,参与多种复杂有机质的降解,在高温沼气发酵中占主导地位[18].报道称,以玉米秸秆等纤维素原料沼气发酵的优势水解细菌属于 Firmicutes门(Clostridia纲)[19-20],Clostridiales能够降解糖类,脂肪和蛋白质产酸[21],并与嗜氢产甲烷菌共生(主要为 Clostridium属),可促进甲烷产生[22].OPB54能够发酵糖类产乙醇和氢气[23]. Thermoanaerobacterales能够水解木质纤维素产乙醇[24].Thermotogae门(超过 98%为S1属)为反应器中的次主导菌群,是厌氧反应器中主要的水解淀粉,蛋白质产酸菌[25],同时是餐厨垃圾,蔬菜废弃物等易水解原料沼气发酵的优势水解酸化细菌[26].

图5 不同水力停留时间各阶段细菌组成变化Fig.5 The percentage changes of different kinds of bacteria at five HRTs

Zhang等[27]研究了HRT对淀粉沼气发酵的影响,HRT由 244h降至 12h,酸化程度无明显变化.HRT由5d降至3,1.5,1和0.5d,进料浓度降低,混合原料中淀粉含量降低,导致淀粉水解菌Thermotogales的比例由41.0%降至6.3%.淀粉等易降解成分的含量降低,消耗速率加快,反应器中纤维素成分的含量相对增加,促使了利用纤维素的Clostridiales和发酵糖类,甘油的OPB54的比例分别由32.9%和3.4%升至66.9%和10%左右.此外,反应器中水解酸化菌还有 Bacteroidales,Synergistales, Rhodocyclales和Xanthomonadales.Bacteridals是纤维素水解菌[28].Synegistales能够氧化长链脂肪酸[29],与产甲烷菌共生,促进甲烷产生.

图6 不同水力停留时间各阶段古菌的组成变化Fig.6 The percentage changes of different kinds of archaeas at five HRTs

2.4.2 古菌群落结构特征的变化 图6所示,HRT为 5d,餐厨垃圾和秸秆高温沼气发酵反应器中嗜氢产甲烷菌 Methanoculleus属和Methanothermobacter 属分别占 57.0%和 24.4%,是优势产甲烷菌,而利用乙酸产甲烷的八叠球菌Methanosarcina占 14.1%,明显低于嗜氢产甲烷菌的数量.Methanoculleus属能够利用H2/CO2,甲酸和乙醇,是玉米秸秆,青贮玉米高温沼气发酵中的优势菌群[19-20],而餐厨垃圾高温沼气发酵中的优势产甲烷菌为 Methanothermobacter 属(95%～97%)[30-31].与嗜氢产甲烷菌相比,嗜乙酸产甲烷菌对环境的改变更加敏感[32].在本试验中,随着HRT的进一步缩短,Methanothermobacter 属的相对丰度提高,成为优势菌群,但Lin等[33]研究温度提升对猪粪沼气发酵的影响时发现,Methanothermobacter 属相对丰度的增加不能提高反应器的产气率.嗜乙酸产甲烷菌Methanosarcina属的相对丰度则随HRT的缩短显著降低,HRT为3,1.5和1d时分别为8.2%,5.8%和1.9%,当HRT缩短到0.5d时,则进一步降低至0.6%.可以推测,随着 HRT的缩短,系统利用乙酸的能力越来越弱.Ahring等[34]报告嗜乙酸产甲烷菌贡献了反应器中 70%的甲烷产量.Niu等[35]研究氨氮累积对鸡粪高温沼气发酵中微生物的影响发现,氨氮抑制前优势菌群为Methanoculleu属和Methanosarcina属,抑制和恢复后,优势菌群变为 Methanothermobacterium 属.Zhou[18]和 Lin等

[33]分别在猪粪单独沼气发酵和猪粪秸秆混合沼气发酵时发现,高温反应器内的优势菌为Methanothermobacterium,Methanosarcina属菌株仅占10%.Zhang等[36]研究发现在低HRT下稳定运行时,餐厨垃圾沼气发酵反应器内的优势产甲烷菌为嗜氢产甲烷菌.Kobayashi等[37]发现污泥高温发酵反应器内的古菌组成为72%的 Methanosarcina属和 28%的Methanothermobacterium属.可见,在高温发酵下,嗜氢产甲烷菌发挥了重要作用,而乙酸产甲烷菌不发挥主要作用.那么,可以推测,在高温短停留时间条件下,甲烷主要来自于二氧化碳和氢,而不是乙酸,乙酸存在通过两阶段式互营途径产生甲烷的可能,即乙酸首先被互营菌氧化生成二氧化碳和氢,再经嗜氢产甲烷菌转化成甲烷.

高温产甲烷菌的增殖速率远高于中温产甲烷菌.即使在高温条件下,嗜乙酸产甲烷菌的菌株倍增时间均在10h以上,增值速率慢;嗜氢产甲烷菌增值速率远高于嗜乙酸产甲烷菌,部分菌株的倍增时间低于 1h,低 HRT条件下,嗜乙酸产甲烷菌更容易被洗出[38],导致Methanosarcina属的相对丰度逐步降低.不同类型嗜氢产甲烷菌增值速率存在较大差异, Methanobacterium典型菌株M. congolense DSM 7095T的倍增时间为7.5h,而Methanothermobacterium典型 菌株 M.thermoautotrophicum ATCC 2918T的倍增时间仅为 1.8h,既可以利用氢又可以利用乙酸产甲烷的Methanosarcina barkeri 典型菌株DSM 804T的倍增时间则为 25h,而 Methanosaeta的倍增时间为 24～65h.因此,随着 HRT 的逐渐缩短,Methanothermobacterium属菌株更易在反应器中富集.

3 结论

3.1 HRT由5d逐级缩短至3,1.5和1d,对应OLR依次为 8.0,6.66,3.33,5.0gVS/(L⋅d),系统运行稳定.VS去除率逐级递减至23.08%,产气率和容积产气率不断减小,pH值稳定在 7.2左右,丙酸/乙酸值均低于0.8.当HRT降为0.5d时,pH值稳定在7.0左右,且未出现VFA累积,但反应器几乎停止产气,微生物发生冲刷流失,VS去除率仅为5.77%.

3.2 餐厨垃圾和秸秆混合沼气发酵过程中,HRT逐级递减至0.5d,嗜氢产甲烷菌(主要为Methanomicrobiales)的比例由 85.9%增至99.1%,而嗜乙酸产甲烷菌由 14.1%降至 0.6%,嗜氢产甲烷途径是餐厨垃圾和秸秆高温共发酵的主要途径.

3.3 随着 HRT减少,嗜乙酸产甲烷途径受到限制.同时,Clostridiales等能够与产甲烷菌共生的水解酸化细菌的比例增加了近 1倍,推测乙酸氧化菌与嗜氢产甲烷菌共生是乙酸降解的主要途径.

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