微量分光光度计的校准方式

张永臣 张蕊 / 黑龙江省计量检定测试院

微量分光光度计的校准方式

张永臣 张蕊 / 黑龙江省计量检定测试院

0 引言

微量分光光度计的出现解决了微量样品采用分光法定性及定量测试的问题。基于此特点，该类仪器被广泛用于生物、医学等检测样本量稀少并且价格昂贵的领域。微量分光光度计属于分光光度计类测试仪器，遵循朗伯比尔定律，但较普通的分光光度计还是有很大的改进。随着仪器使用量的增多，不得不考虑该类仪器的溯源性问题。2015年相关部门提出并计划编制该类仪器的校准规范，但至今还未出版正式的国家校准规范。本文针对微量分光光度计的测试原理和功能特点，分别对两种校准方式进行了探讨，并提出了建议。

1 微量分光光度计的测试原理及功能特点

微量分光光度计的独特之处在于它对测试样品量的要求非常低，现有的仪器中可测量最低为0.3 μL的样品，可以节省非常稀少且昂贵的样品量。检测波长范围200～1 000 nm，多数仪器设定了定点测试波长230 nm、260 nm和280 nm，便于DNA、RNA和蛋白质的测试。采用发光稳定且不需预热的氙灯代替钨灯和氘灯作为光源，寿命更长，光强更大。该类仪器中精度稍高的都在使用电感耦合阵列检测器（CCD），其光谱范围、量子效率、信噪比等指标都远高于光电二极管阵列。

使用该类仪器多用其基座检测模式，该功能是实现微量测试的关键技术。即，用微量移液枪吸取样品滴加在检测基座上，基座上包埋了一根接受光纤，放下检测臂与液体接触，检测臂上有检测光纤，应用液体的表面张力在检测基座和检测臂之间自动形成标准液柱。液柱高度相当于光程，液柱高度可设定为0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm等。光源发出的光经过光纤传导并通过液柱由检测器接受并进行一系列的计算。其过程如图1～3所示。

图1 取样滴加

图2 样品滴加在检测基座上

图3 形成标准液柱

与普通的分光光度计相比，从点样到测试完成的时间大大缩短，且省去了清洗比色皿的程序。该检测基座只需用拭镜纸擦拭即可。该类仪器可以实现的检测功能如下：普通的紫外-可见分光光度计检测、DNA/RNA浓度检测、蛋白质浓度检测等。

2 微量分光光度计的校准方法分析

通过查阅资料，现有的微量分光光度计普遍具有的技术参数，如表1所示。

与普通的分光光度计比较，一些基本的技术参数还是比较一致的。但是该类仪器预设了DNA、RNA、蛋白质、荧光染料吸光度值与浓度的对应关系，所以可以直接给出这些样品的浓度值。根据以上技术参数及测试原理，对微量分光光度计的校准就有两种思路，一是从分光光度计的原理参照普通分光光度计的检定规程JJG 178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计》来校准，另一种思路是从该类仪器的测量结果入手，以浓度标准物质来校准其测量值的示值误差等。下面对两种思路做分析对比，并给出合理建议。

表1 微量分光光度计技术参数

2.1 以滤光液标准物质进行校准

该方法可以参照JJG 178-2007进行部分项目的校准。可将波长准确性、波长重复性、吸光度准确性、杂散光等仪器主要关键的技术指标列为校准项目。对波长准确性和波长重复性的校准可以使用现有的氧化钬波长溶液标准物质，该标准溶液在波长240～650 nm 范围有10个以上尖锐、峰位明确的吸收峰。吸光度的准确性可以使用JJG 178-2007给出的方法，配制一定浓度的重铬酸钾高氯酸溶液或重铬酸钾硫酸溶液，用高精度的紫外可见风光光度计定值其在235 nm、257 nm、313 nm、350 nm处的吸光度值。通常是在光程为10 mm定值，使用时可根据朗伯比尔定律A=- kLc来转换更小光程时的吸光度值，当仪器给出的是标准为光程10 mm的吸光值时则不需要将标准值换算即可进行比较。其次要注意校准时环境温度与定值时温度的匹配性。杂散光特性可以根据JJG 178-2007的要求使用10 g/L的碘化钠溶液和50 g/L的亚硝酸钠分别在220 nm和340 nm处检测仪器的透光率或吸光度值。以上校准方式和项目是基于微量分光光度计的测量原理，结合生产商给出的技术参数，使用者可以利用校准结果对被校仪器有一个综合的评价。此外，如果希望进一步了解仪器的基线平直度和基线噪声等指标也可参照JJG 178-2007来制定校准方法。

2.2 以浓度标准物质进行校准

该方法是在微量分光光度计可以直接测定核酸和蛋白质类物质的含量值基础上，以DNA标准物质、RNA标准物质或蛋白质标准物质来测定标准物质的测量值与标注值之差作为仪器的示值误差来评价仪器的计量特性。该类仪器预设了定点波长测试功能，并且预设了吸光度值与浓度值的关系。核酸和蛋白质的最大吸收波长260 nm、280 nm，为了判断核酸或蛋白质的纯度还增加了A230 nm用来表示样品中存在的一些污染物如碳水化合物、苯酚、多肽等，A320 nm用来表示样品的浑浊度和其他干扰因子。用浓度标准物质来校准该类仪器还可以将测量值的重复性和仪器的线性纳入校准项目，当然仪器线性的评价需要用到不同浓度的系列标准溶液。

3 结语

综合上述分析，第一种校准方式在稍加细化的基础上即可以开展校准工作，且对于广大的计量工作者来讲比较容易上手，标准物质价格较低且容易获得。而后一种校准方式虽然可以给出微量分光光度计的测量结果的示值误差、线性等计量特性优劣，但在实际校准过程中如何选定标准物质，仅单一标准物质还是核酸类和蛋白质类共同使用，因为两者是在不同的吸收波长下进行定量测量，考查的是不同波长下浓度测量的准确性。而且还需要考虑DNA或RNA标准物质及蛋白纸标准物质的稳定性、经济性和易获得性，且对存储条件的要求不能太高，尤其是有些DNA含量标准物质的存储温度要求较低，不便于计量工作人员进行现场校准。所以在JJG 178-2007的基础上研制一套系列标准液，对该类仪器的波长准确性、吸光度准确性、杂散光等计量特性进行校准，通过校准结果可以客观、全面地评价仪器的技术指标，给使用者了解该仪器提供更加综合的数据。

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