抗青枯病病菌植物杀菌剂的研究
2018-01-06曹鹏飞陈银华周慧娟范芳娟杨继
曹鹏飞+陈银华+周慧娟+范芳娟+杨继
摘要： 为研究抗青枯病病原菌的植物杀菌剂，以8种植物为材料，从中筛选出抑菌效果较好的有效植物，并采用单因素和二次正交旋转组合试验对其最适乳油配方及其稳定性进行研究。结果表明，银杏、马尾松2种提取物的抑菌效果均显著高于农用链霉素，其中马尾松提取物的抑菌效果最好，抑菌圈直径达9.06 mm。植物提取物在丙酮中溶解效果好于其他溶剂，在吐温-80中的分散最佳，且最稳定。有效植物提取物的最适乳油配方为：506 mg/mL水杉提取物，827 mg/mL马尾松提取物，481 mg/mL银杏提取物，409 mg/mL野艾蒿提取物，0.205 mL/mL溶剂的乳化剂。该试验结果可为植物源杀菌剂的综合开发利用提供理论依据。
关键词： 青枯病；植物源杀菌剂；二次正交旋转组合试验；植物源杀菌剂
中图分类号： S482.2+92 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）22-0102-06
青枯病是一种全世界范围广泛分布的细菌性土传病害，在高温、高湿的热带、亚热带地区大量流行，是农业可持续发展的主要障碍之一[1]。青枯病害往往发生在梅雨季节过后，造成植物连片死亡和大幅度减产，发病后期，治疗比较困难，是一种系统侵染病害，如果土壤酸化严重、板结厉害，青枯病会大面积发生，甚至造成毁园。该病是由青枯假单胞杆菌[茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）]引起的[2]，通过根和茎的伤口或次生根的根冠进入植物体，侵染寄主的木质部，然后在整个维管束中蔓延，引起严重的萎蔫最终导致植物死亡[3]。青枯病菌在农作物中分布范围广，能侵染多达50个科200种作物，在番茄、辣椒、烟草等茄科作物中普遍发生。
近年来，青枯病的防治主要以化学药剂为主，如琥珀酸铜、青枯灵和噻菌铜等。但防治青枯病主要以推迟发病高峰期、减轻发病程度为目的，尤其在大面积发病时才进行用药防治已经基本没有效果。此外，长期使用化学农药易导致植株产生抗药性，造成土壤恶化、生态平衡破坏、农药残留等问题，危害到人类身体健康，并且造成很大的经济损失[4]。因此，寻求安全性高且不易产生抗药性的杀菌剂，已受到广泛关注。据相关研究表明，几乎每种植物都能产生抑菌活性，但是抑菌效力和抑菌范围还存在差异[5-7]，且研究表明银杏[8]、大蒜[9]、黄花蒿[10]、紫茎泽兰[11]等对青枯病菌有较好的抑制作用，因此研究开发安全生态的抗青枯病病原菌的植物源杀菌剂具有一定的可行性。
本研究以银杏外种皮、樟树枝叶、水杉枝叶、马尾松针、八角金盘叶、冬青卫矛叶、龙葵根、野艾蒿等为植物材料，筛选出具有较强抗青枯病病原菌能力的有效植物，并对各植物提取物的最适抑菌浓度、最佳溶剂、最适乳化剂及其浓度进行优化，旨在制备出具有最佳抑菌效果的乳油剂型，旨在为植物源杀菌剂的综合开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试验材料
樱桃番茄青枯病病原菌，自行分离得到。
银杏外种皮、樟树（枝叶）、水杉（枝叶）、马尾松针、八角金盘（叶）、冬青卫矛（叶）、龙葵（根）、野艾蒿（花序）等植物材料，采自浙江省丽水市莲都区白云山、纳爱斯广场、丽水学院校园以及南明山等地。
1.1.2 主要试剂
吐温-80、N，N-二甲基甲酰胺、吐温-20、二乙醇胺、BY-130、农乳-600，以上试剂均为化学纯。1%的纤维二糖、1%乳糖、1%麦芽糖、1%己六醇、1%甘露醇、1%山梨醇丙酮、苯、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、冰醋酸，以上试剂均为分析纯。
1.1.3 培養基
TTC培养基[12]、牛肉膏蛋白胨培养基[13]、休和利夫森二氏培养基[14]、SPA培养基[15]、NA培养基[16]。
1.1.4 主要仪器
双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-2FD）、立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂，LDZX-75KB）、生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司，BA210）、生化培养箱（上海益恒实验仪器有限公司，LRH-250）、723C可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司，Q/TBCR2）、智能恒温摇床（太仓市实验设备厂，DHZ-C）、旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂，RE-52A）、SHZ-95型循环水式多用真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂，1230211405）等。
1.2 试验方法
1.2.1 植物样品的采集与处理
随机选取样品植株（银杏外种皮、樟树枝叶、水杉枝叶、马尾松针、八角金盘叶、冬青卫矛叶、龙葵根、野艾蒿花序）装入塑封袋中，标上样品序号、采样地点等数据信息，带回实验室。将植物样品洗净，于 60 ℃ 烘干后粉碎过40目筛备用。
1.2.2 植物提取物的制备
取植物粉碎样品，加入4倍体积的丙酮，置于避光阴凉处，140 r/min震荡提取3次，每次振荡时间为24 h，合并3次滤液后，旋转减压浓缩至膏状物。
1.2.3 青枯病病原菌菌悬液的制备
将病原菌接种至SPA培养基中，于30 ℃条件下培养2 d后，将青枯病病原菌菌悬液稀释至1.0×108个/mL备用。
1.2.4 植物提取物抑菌效果的测定
采用滤纸片法[17]测定植物提取物的抑菌效果。
1.2.5 抗青枯病病原菌植物提取物的筛选
将有效植物提取物稀释至50 mg/mL，测定其抑菌圈直径（mm），以筛选出具有抑菌作用的有效植物提取物。
1.2.6 抗青枯病病原菌有效植物提取物乳油配方的单因素试验
1.2.6.1 植物提取物最适杀菌浓度的确定
用丙酮将有效植物提取物稀释至25、50、100、200、400、800 mg/mL，筛选出最佳浓度。
1.2.6.2 溶剂的筛选
将4种有效植物提取物均等混合，取约10 mg点于凹形载玻片的凹面内，再用移液枪吸取50 μL的溶剂（丙酮、苯、乙醇、乙酸乙酯、甲醇）点于浓缩物的一侧，加盖玻片，观察扩散速度；室温静置1 h后，观察溶解情况。
1.2.6.3 乳化剂的筛选及其最适浓度的确定
将4种有效植物提取物均等混合，取100 mg植物提取物，2 mL丙酮，每种乳化剂（吐温-20、吐温-80、农乳-600、BY-130）设5个浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL），用溶剂溶解浓缩物后，配制成乳油，进行乳油分散情况和稳定性的观察试验，能迅速地自动分散为乳白色透明溶液，静置后为均乳、无分离物，则为合格。
1.2.7 二次正交旋转组合设计优化有效植物提取物最适乳油配方
在上述单因素试验基础上，以各有效植物提取物和乳化剂浓度为试验因素，以抑菌圈大小为考察指标，采用二次正交旋转组合试验优化有效植物提取物的最适乳油配方，旨在制备出具有最佳抑菌效果的乳油剂型。
1.3 数据处理
所有数据分析均用DPS 9.50软件完成。
2 结果与分析
2.1 抗青枯病病原菌有效植物提取物的筛选
方差分析结果表明，不同植物提取物的抑菌效果具有极显著差异（F=12.561，P<0.01）。由图1可知，银杏、马尾松提取物抑菌效果均显著高于农用链霉素，其中马尾松提取物抑菌效果最好，最大抑菌直径为9.06 mm。水杉、野艾蒿提取物的抑菌效果明显高于农用链霉素，但不显著。香樟提取物则与农用链霉素抑菌效果相当。因此，选择水杉、银杏、马尾松、野艾蒿这4种植物提取物作为乳油配方的有效提取物。
2.2 抗青枯病病原菌有效植物提取物乳油配方单因素试验
2.2.1 有效植物提取物浓度对青枯病病原菌的抑菌效果
由图2～图5可知，在25～800 mg/mL浓度范围内，4种植物提取物的抑菌效果随其浓度的增加而逐渐增强。当水杉、马尾松、银杏提取物浓度在100～400 mg/mL时，其抑菌圈直径均明显增加。在800 mg/mL时，抑菌圈直径均达到最大值，分别为1069、10.84、11.13 mm。野艾蒿提取物在50～400 mg/mL 浓度范围内，抑菌圈直径随浓度的增加明显增大，抑菌效果随浓度升高呈明显上升趋势。在400～800 mg/mL浓度范围内，抑菌圈直径基本保持不变，抑菌效果趋于稳定，抑菌圈直径在10.50 mm左右。
2.2.2 最佳溶剂、乳化剂的筛选及其最适浓度的确定
4种植物提取物混合后在6种溶剂 （丙酮、苯、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺）中的溶解度分别为0200、0.125、0、0.091、0.200、0.125 mg/μL，扩散速度大小依次为：丙酮>苯>甲醇>乙酸乙酯=乙醇>N，N-二甲基甲酰胺。这表明丙酮和乙醇均具有良好的溶解效果，但考虑到乙醇扩散速度不佳，故选用丙酮作为溶剂。
由表1可知，4种乳化剂在乳化过程均具有较好的稳定性，在放置1 h后均未出现分层现象。但就分散情况而言，4种乳化剂表现出不同的结果。吐温-80的分散效果最佳，且当吐温-80在0.20 mL/mL溶剂浓度下制备的乳油分散效果明显优于其他乳化剂，乳油清亮无浑浊，长久放置不分层，故乳油配方选用吐温-80为乳化剂。
2.3 二次正交旋转组合设计优化有效植物提取物最适乳油配方
根据上述单因素试验结果，以抑菌圈直径大小为考察目标，以水杉提取物浓度（X1）、马尾松提取物浓度（X2）、银杏提取物浓度（X3）、野艾蒿提取物浓度（X4）、乳化剂浓度（X5）为考察因素，进行5因素5水平的二次正交旋转试验，以确定最适的乳油配方。试验因素水平编码如表2所示，试验方案与结果如表3所示。
2.3.1 回归模型建立与检验
采用DPS数据处理系统对表3中的结果进行二次多项式逐步回归分析，得到水杉提取物、马尾松提取物、银杏提取物、野艾蒿提取物、乳化剂浓度的回 归模型：Y=9.215 57+0.236 18X1+0.407 26X2-0.182 55X3- 0096 47X4+0.205 97X5+0.304 84X12-0.064 04X22+0165 21X32-0.117 73X42-0.165 60X52+0.355 70X1X2- 0251 77X1X3-0.123 33X1X4-0.106 92X1X5+0.164 73X2X3-0324 70X2X4+0.311 45X2X5-0.058 36X3X4-0.052 52X3X5+ 0010 42X4X5。
由表4可知，回歸方程的失拟性检验，F1=1.498 64
Y=9.215 57+0.236 18X1+0.407 26X2-0.182 55X3+0.205 97X5+0.304 84X12+0.165 21X32-0.165 60X52+0355 70X1X2-0.251 77X1X3-0.324 70X2X4+0311 45X2X5。
2.3.2 主效应分析
P值即概率，反映某一事件发生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素对试验指标的重要性，P值越小，表明该因素对试验结果影响越大，即重要性越大。由表4可知，5个试验因素对抑菌效果影响大小依次为马尾松提取物浓度>水杉提取物浓度>乳化剂浓度>银杏提取物浓度>野艾蒿提取物浓度。
2.3.3 单因子效应分析
当水杉提取物浓度、马尾松提取物浓度、银杏提取物浓度、野艾蒿提取物浓度、乳化剂浓度这5个影响因素中的任意4个为0，其中一个对抑菌效果的影响见图6。由图6可知，在-2.0～0水平下，水杉和银杏提取物的抑菌效果随浓度升高而下降，但在0～2.0水平时，却随浓度升高而升高，这可能是由于植物提取物间存在着抑制作用，在低浓度时，水杉和银杏对其他植物的抑制较弱，体现了其他植物较好的抑菌效果，而到达0水平时，抑菌效果的下降则与水杉和银杏与其他植物间的抑制作用逐渐增强直接相关。到达高水平时，抑菌效果又明显增加，表明银杏和水杉提取物的抑菌效果强于植物间的抑制作用。
在-2.0～0水平下，马尾松提取物和乳化剂浓度的升高均可以增加抑菌效果，但在0～2.0水平时，再增加乳化剂浓度却使抑菌效果略微下降，这可能是乳化剂浓度过高导致植物提取 物不能充分溶解；而抑菌效果随马尾松提取物浓度的增加呈线性上升趋势，表明马尾松提取物浓度对抑菌效果的影响明显。野艾蒿提取物浓度的改变对抑菌效果的影响不明显。
2.3.4 双因子效应分析
从交互项系数可以看出，马尾松与水杉提取物、马尾松提取物与乳化剂以及马尾松与野艾蒿提取物3种组分的交互作用达到极显著水平；水杉与银杏提取物的交互作用达到显著水平，表明4种组分之间的配比对抑菌作用有显著影响，响应面结果如图7至图10所示。
在水杉提取物浓度较低时，马尾松提取物浓度的增加对抑菌效果的影响不明显，而当浓度增大到0～2.0水平时，马尾松提取物浓度的改变对抑菌效果的影响明显。在马尾松提取物为低浓度水平时，水杉浓度在-2.0～0.5水平时，抑菌直径呈下降趋势，在1.0～2.0水平，则有所上升。可见在 -0.5～1.0水平下的水杉与其他植物间具有较强的抑制作用，在低于这个浓度时，其他植物的抑菌效果显然强于水杉的抑制作用，而高浓度的水杉提取物则对抑菌效果影响明显。
当乳化剂浓度处于较低水平时，马尾松提取物浓度的增加对抑菌效果的影响不明显，可能是马尾松提取物并未能全部溶于溶剂中，但在高浓度的乳化剂下，随着马尾松提取物浓度的增加抑菌效果明显；而马尾松提取物浓度较低时，乳化剂浓度的增加可使马尾松提取物浓度下降导致抑菌效果减弱。
在水杉提取物浓度最低和银杏提取物浓度最高以及银杏提取物浓度最低和水杉提取物浓度最高时，抑菌直径达到最大。而在银杏和水杉浓度都为最高时，抑菌直径却较小，可见这2种植物间存在抑制作用。
在马尾松提取物浓度为-2.0水平时，随野艾蒿提取物浓度的增加抑菌效果呈上升趋势；当野艾蒿浓度为-2.0水平时，随着马尾松提取物浓度增加抑菌效果逐渐加强。而在-2.0～1.5水平时，随着两者浓度等量增大时抑菌效果也逐渐增大，两者都处于2.0水平时，抑菌效果却下降，可见两者存在相互促进作用，而高浓度提取物的抑菌效果的下降可能与提取物不能充分溶解有关。
2.3.5 有效植物提取物最适乳油配方寻优及验证
对不同设计水平下的组合进行模拟试验，从55=3 125个组合中，获得抑菌直径>9.30 mm的方案1 940个。根据频次分析结果和实际情况取任一值即可得出优化组合，现取中值可得出，各组分的优化组合为水杉提取物浓度506 mg/mL，马尾松提取物浓度827 mg/mL，银杏提取物浓度481 mg/mL，野艾蒿提取物浓度 409 mg/mL，乳化剂浓度0.205 mL/mL溶剂，预测抑菌直径为9.49 mm。经多次的验证性试验，该乳油配方的抑菌直径为9.2 8 mm，与预测值无显著差异（F=2177，P>0.05），说明该模型与试验相吻合，能适用于生产实践。
3 讨论
3.1 抗青枯病病原菌植物提取物的筛选
相关研究表明，几乎每种植物都能产生抑菌活性，但是抑菌效力和抑菌范围存在着差异。冀玉良等研究发现，银杏、大蒜、黄花蒿、紫茎泽兰等植物对青枯病菌均有较好的抑制作用[8，10，18-19]。本试验从银杏、樟树、水杉、马尾松、八角金盘、冬青卫矛、龙葵、野艾蒿中筛选出银杏、马尾松、野艾蒿、水杉4种较农用链霉素具有明显抑菌效果的植物，其中马尾松的抑菌效果最强，这可能与其所含的萜类化学物质有关，如薄采颖等研究表明，松针叶二萜酸对番茄灰霉病菌也有明显抑制作用[20]。由此表明，马尾松提取物具有较强的抑菌作用，可作为新型植物源农药重点开发的研究对象。
3.2 有效植物提取物乳油配方的优化
大量研究证明，二次正交旋转组合试验设计与传统的单因子试验法、正交试验法相比，能根据预测值直接寻求最优区域，从多角度对模型进行模拟分析，以充分发掘模型所提供的信息[21-23]。故本试验以各有效植物提取物、乳化剂浓度为试验因素，采用二次正交旋转组合试验进行优化，得到最优乳油配方为： 水杉提取物506 mg/mL， 马尾松提取物 827 mg/mL，
银杏提取物481 mg/mL，野艾蒿提取物409 mg/mL，吐溫-80 0205 mL/mL溶剂，经验证试验后抑菌直径与预测值 9.49 mm 无显著差异。由单因子效应分析可知，马尾松提取物浓度与抑菌效果的关系呈线性上升趋势，较其他植物提取物对抑菌效果有极显著影响。毛胜凤等研究发现，马尾松提取物在浓度为12.5～100.0 mg/mL时抑菌效果随着浓度的增大而增大[24]。本试验中马尾松浓度在25～400 mg/mL范围内，抑菌直径呈线性上升趋势，而浓度高于400 mg/mL后抑菌效果趋于平缓，表明在低浓度时马尾松抑菌效果随浓度增大而显著增大，但高于一定水平时，马尾松的抑菌效果则会趋于稳定，这可能与溶剂的溶解度大小有关。从双因子互作效应分析可知，马尾松提取物浓度较高时，随着乳化剂浓度的增加抑菌效果明显增加，研究表明天然的植物源杀菌剂在作用于寄主时，其渗透性、延展性都是有限的，须添加助剂使其充分发挥药效[25-26]。本试验研究表明，吐温-80乳化剂的添加能增加有效植物提取物的渗透性和延展性，可达到增效的作用。在乳油剂型中，溶剂是其加工和使用中不可或缺的重要组分，用于溶解和稀释原药协助乳化分散，增加乳油流动性[27-28]。根据蔡亚东的研究表明，龙葵素乳油具较好扩散性和溶解度的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺和二甲苯，而丙酮则相对效果较差[29]。本试验通过对溶剂的扩散情况和溶解度的测定，确定丙酮为有效植物提取物乳油的最佳溶剂。由此可见，溶剂的选择具有针对性。
综上所述，经二次正交旋转组合试验优化得到植物提取物的最适乳油配方，抑菌效果显著优于农用链霉素。但该乳油配方仍存在着不少问题，如植物活性成分难分离、易分解的问题还有待解决，乳油剂型的稳定性还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 肖相政，刘可星，廖宗文. 生物有机肥对番茄青枯病的防效研究及机理初探[J]. 农业环境科学学报，2009，28（11）：2368-2373.
[2]张 彦，车建美，刘 波，等. 蜡样芽孢杆菌ANTI-8098A在番茄内的定殖和对青枯病的防治研究[J]. 中国生物防治学报，2011，27（2）：221-227.
[3]高君君. 植物根际促生菌的筛选及其对番茄青枯病的生防作用[D]. 扬州：扬州大学，2011：16-17.
[4]李永刚. 一种植物源杀菌剂的研制及其在番茄叶霉病防治中的应用[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2003：10-11.
[5]王志学，黄廷钰，胡永兰，等. 抑菌植物研究初报[J]. 微生物学杂志，1999，19（4）：49 - 57.
[6]李百健，曾 荣，黄长干，等. 植物杀菌剂的筛选[J]. 西南大学学报（自然科学版），2010，32（10）：28-31.
[7]梁晓华，梁晓东，穆琼堂，等. 云南省4种蕨类植物提取液的抑菌活性[J]. 基因组学与应用生物学，2010，29（4）：711-716.
[8]冀玉良. 利用银杏外种皮提取液抑制农作物病原菌初步研究[J]. 农业网络信息，2005（9）：76，84.
[9]张汉千，赖荣泉，陈志敏，等. 大蒜粗提物对烟草青枯病菌的室内抑制作用测定[J]. 烟草科技，2009（3）：62-64.
[10] 吴 静. 黄花蒿的抑菌活性及有效成分的初步分离研究[D]. 重庆：西南大学，2008：20-21.
[11]李丽萍. 紫茎泽兰提取物对细菌的抑制作用及抑菌机理的研究[D]. 北京：北京林业大学，2010.
[12]车建美，刘 波，张 彦，等. 青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法的研究[J]. 福建农业学报，2011，26（5）：804-807.
[13]张 通，卢文玉，田 春. 絮凝剂产生菌培养基的研究[J]. 应用与环境生物学报，2003，9（1）：67-70.
[14]王晓丹，闵凡祥，郭 梅，等. 马铃薯青枯病菌生化型研究及菌株接种方法的比较[J]. 中国马铃薯，2010，24（1）：38-40.
[15]何昭阳，胡桂学，王春凤. 动物免疫学实验技术[M]. 长春：吉林科技出版社，2003.
[16] 崔朝宇，张超群，周泽科，等. 烟草青枯病菌分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定[J]. 江西植保，2012，35（2）：153-156.
[17]欧阳玉祝，唐赛燕，秦海琼，等. 海金沙提取物体外抑茵性能研究[J]. 中国野生植物资源，2009，28（3）：41-44.
[18]商胜华，陆 宁，陈庆园，等. 大蒜提取液对烟草黑胫病和青枯病的防治效果初探[J]. 贵州农业科学，2009，37（10）：94-96.
[19]李 丽. 紫茎泽兰对植物病原菌抑制作用的研究[D]. 昆明：云南师范大学，2008：56-58.
[20]薄采颖，许小芬，郑光耀，等. 马尾松针叶二萜酸对植物病原菌抑制作用的研究[J]. 林产化学与工业，2011，31（1）：73-76.
[21]朱战波，刘 宇，贾永全，等. 二次正交旋转组合设计优化罗伊乳杆菌发酵培养基[J]. 中国生物制品学杂志，2008，21（6）：527-530.
[22]莫美华，庞雄飞. 二次正交旋转回归设计在小菜蛾蛾饲料配方筛选中的应用[J]. 生態学报，2007，27（7）：2935-2941.
[23]杨 松，周蓓蓓，程江华，等. 二次正交旋转组合设计优化药桑花青素提取工艺[J]. 生态学报，2012，33（8）：33-38.
[24]毛胜凤，张立钦，张 健，等. 马尾松叶提取物的抗菌活性[J]. 浙江林学院学报，2008，25（3）：359-362.
[25]刘均玲. 防治番茄灰霉病植物提取物的筛选与研究[D]. 保定：河北农业大学，2003.
[26]王庆利，彭 健. 吐温80的安全性研究进展[J]. 毒理学杂志，2006，20（4）：262-264.
[27]刘跃群. 生物柴油作为茎叶处理除草剂乳油加工溶剂的应用潜力研究[D]. 泰安：山东农业大学，2009：56-57.
[28]刘天学，纪秀娥. 影响复配农药乳油稳定性因素初探[J]. 河南化工，1998（9）：35-36.
[29]蔡亚东. 蒲公英、龙葵的抑菌活性及其加工制剂的研究[D]. 兰州：甘肃农业大学，2003：15-16.
