miR-429过表达对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响及机制

孙少鹏，孔广起，贤少忠，蔡大伟

(首都医科大学附属北京潞河医院，北京通州101149)

miR-429过表达对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响及机制

孙少鹏，孔广起，贤少忠，蔡大伟

(首都医科大学附属北京潞河医院，北京通州101149)

目的探讨miR-429过表达对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响及机制。方法将常规培养好的膀胱癌细胞T24随机分为对照组、miR-429组，对照组转染miR-NC(无关序列的mimics)，miR-429组转染插入miR-429的目标片段。用划痕试验检测两组迁移能力，Transwell侵袭试验检测其侵袭能力。采用实时PCR技术检测T24细胞内E盒结合锌指蛋白(ZEB1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及钙黏附蛋白E(E-cadherin)mRNA表达，用免疫印迹法检测T24细胞内ZEB1、MMP-2及E-cadherin蛋白表达。结果与对照组比较，miR-429组细胞迁移距离短，迁移细胞数少(P均<0.05)，细胞内ZEB1、MMP-2 mRNA及蛋白表达低，E-cadherin mRNA及蛋白表达高(P均<0.05)。结论miR-429b过表达可能通过靶向抑制膀胱癌细胞内ZEB1、MMP-2表达,增强E-cadherin的表达阻止膀胱癌细胞迁移、侵袭。

膀胱癌；微小RNA-429；细胞迁移；细胞侵袭

膀胱癌是一种恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的1%～2%，其发病率与病死率均居泌尿系肿瘤的首位，且约50%的患者术后复发[1]。上皮间充质转化(EMT)是肿瘤细胞发生侵袭转移的关键步骤，其表现为上皮钙黏连蛋白的丢失与上皮钙黏连蛋白阻遏物表达的增加[2]。在EMT过程中细胞外基质发生溶解，是膀胱癌通过血液和淋巴系统发生远处转移的重要作用机制之一[3]，其中起主要作用的酶为基质金属蛋白酶2(MMP-2)。微小RNA(miRNA)是一类由18～24个单核苷酸组成的非编码RNA[4，5]。miR-200家族可靶向调控多种参与EMT基因的表达[6]。miR-200c可抑制膀胱癌细胞侵袭与增殖[7]，miR-200c与miR-205协同作用抑制膀胱癌的转移[8]。目前有关miR-429在膀胱癌中的作用尚未见明确报道。2015年9月～2016年12月，本研究对此进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器及其来源 膀胱癌细胞T24由本试验室提供。DMEM高糖培养基购自美国Sigmag公司；胎牛血清购自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶购自长沙研科生物科技有限公司；一抗、二抗购自武汉三鹰科技有限公司；细胞培养板购自美国Costar公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce Chemical公司，5×SDS蛋白上样缓冲液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、脱脂奶粉及过硫酸铵均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；D-Hanks缓冲液由本试验室自行配制。倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；CO2培养箱购自美国Forma公司；恒温-80 ℃冰箱购自中国海尔(Haier)集团；电泳仪、转膜仪购自美国伯乐生物科技公司；板式酶标仪购自中国北京新风机电公司。

1.2 细胞培养及转染 取含胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养T24细胞。用含0.02% EDTA的胰酶消化液消化细胞，待细胞传至第4、5代，选择增殖旺盛、生长状态良好的细胞进行试验。将细胞接种入6孔板，生长至50%～60%将其分为对照组、miR-429组，采用脂质体转染法，对照组转染miR-NC(无关序列的mimics)，miR-429组转染插入miR-429的目标片段5′-TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3′，6 h后换液。转染48 h后收集细胞，用实时PCR检测mRNA表达，其过表达效率≥90%，证明转染成功。

1.3 T24细胞迁移能力检测 采用划痕试验。转染细胞密度达90%后，用规格为10 μL的枪头在6孔板上分别做横向、纵向各3条划痕，分别加入细胞增殖抑制剂羟基脲，培养48 h，观察两组细胞迁移情况并拍照，测算细胞迁移距离。

1.4 T24细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭试验。于试验前1 d将基质胶放置于4 ℃恒温冰箱中滆化、过夜。试验前将所用枪头在冰上预冷0.5 h，基质胶与预冷的无血清培养基按1∶7的比例进行稀释，每孔加入稀释后的基质胶15 μL，于37 ℃培养箱中孵育2～3 h；转染1 d后，收集两组细胞，用胰酶消化6孔板中的细胞，用浓度为10%血清培养基终止消化，离心，清除含血清的培养基，加入无血清培养基并重新悬浮细胞，细胞稀释为5×105/mL，每孔加入细胞悬液200 μL；24孔板小室下层加入20% FBS血清800 μL，以供细胞进行侵袭；1～2 d后，显微镜下观察到细胞已侵袭至24孔板底部时立即终止侵袭试验，弃小室中培养基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，并用0.1%结晶紫对穿过小室的细胞染色10 min，清水漂洗3次，用棉签轻轻擦掉上层未侵袭细胞。显微镜下观察并拍照。计算侵袭至小室下层的细胞数。

1.5 T24细胞内E盒结合锌指蛋白(ZEB1)、MMP-2及钙黏附蛋白E(E-cadherin)mRNA表达检测 采用实时PCR技术。用TRIzol法提取两组细胞总RNA，将其逆转录合成cDNA。反应条件：42 ℃、60 min，70 ℃、10 min。将cDNA作为模板，用实时PCR技术，U6为内参照，每个样品设置3个复孔。ZEB1引物：P1：5′-gcacaaccaagtgcagaaga-3′，P2：5′-catttgcagattgaggctga-3′；MMP2引物：P1：5′-gctccaccacctacaactttgagaa-3′；P2:5′-tgtgataggatgtgccctggaa-3′；E-cadherin引物：P1：5′-tacactgcccaggagccaga-3′，P2：5′-tggcaccagtccggatta-3′。反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共39个循环；然后95 ℃、15 s， 60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。通过2%琼脂糖凝胶电泳及熔解曲线鉴定qRT-PCR产物，并用2-ΔΔCt法进行定量分析。

1.6 T24细胞内ZEB1、MMP-2及E-cadherin蛋白表达检测 采用免疫印迹法。 使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，总蛋白经BCA法测定浓度后，以30 μg/孔加样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，将转印了蛋白的PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭，并培育一抗及相应的HRP标记二抗，ECL化学发光法显影。使用Quantityone软件测定条带灰度值，蛋白的相对含量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

2 结果

2.1 miR-429过表达对T24细胞迁移、侵袭能力的影响 培养48 h，对照组、miR-429组迁移距离分别为(10.09±0.4)、(5.2±0.23)mm。miR-429组细胞迁移距离短于对照组(P<0.05)。对照组、miR-429组迁移细胞数分别为(102±3)、(36±8)个。miR-429组迁移细胞数少于对照组(P<0.05)。

2.2 miR-429过表达对T24细胞ZEB1、MMP-2、E-cadherin表达的影响 见表1。

表1 两组ZEB1、MMP-2、E-cadherin表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

膀胱癌为泌尿系常见的恶性肿瘤之一，年新增病例38.63万，病死病例15.02万，发病率在恶性肿瘤中居第9位，致死率列全球男性泌尿生殖系统肿瘤第2位。75%的患者为非肌层浸润膀胱癌，5年生存率较高；25%为肌层浸润膀胱癌，在首次积极治疗后容易发生转移。探寻基于分子网络的新型治疗模式、早期诊断及预后标志物成为近年研究的热点。EMT是指具有极性结构的上皮细胞丧失紧密连接结构的过程。在该过程中，上皮细胞转变为间质细胞，获得了间质细胞的分子标记物，且具有更强的侵袭和迁移能力。EMT与肿瘤转移具有相同的特点，即调节因素多、机制复杂。

miRNA通过与其靶mRNA分子3′非编码区特异碱基部分完全或不完全配对结合，从而导致其发生降解或翻译抑制,于转录后水平调控基因表达。研究证实，miRNA可调控>60%的人类蛋白编码基因，并在多种病理生理进程中发挥关键作用。miRNA既可作为抑癌基因又可作为原癌基因参与肿瘤的发生发展。鉴于其疾病/组织特异性表达图谱及惊人的调控潜能，miRNA已成为肿瘤诊断及预后的标志物。miR-429是miR-200家族中具有抑癌作用的成员之一。本研究证实，miR-429过表达对T24细胞迁移能力起到了一定的抑制作用，并同时抑制细胞侵袭，其主要原因可能为miR-429过表达抑制肿瘤细胞EMT的发生，延缓其进程。miR-429能够抑制ZEB1的表达同时恢复E-cadherin的表达，从而阻滞膀胱癌发生侵袭转移。目前研究认为，miR-429在多种肿瘤组织中表达下调，如膀胱癌[9]、胃癌[10]、肾癌[11]、结直肠癌[12]和鼻咽癌[13]，在其他肿瘤组织中miR-429的表达也发生上调。miR-200家族可直接靶向ZEB1和ZEB2，进而抑制EMT的发生。过表达miR-200c能够升高E-cadherin的表达[14]。本研究也发现，过表达miR-429能够抑制ZEB1的表达，恢复E-cadherin的表达。在miR-429所介导的EMT信号通路中E-cadherin是十分重要的指标，ZEB1与ZEB2在膀胱癌组织中的表达异常升高[15]，并且ZEB2的高表达与膀胱癌患者的不良预后存在相关性，同时E-cadherin的丢失也会导致患者预后不良。

综上所述，miR-429能够通过靶向抑制ZEB1的表达实现对EMT的抑制，从而遏制肿瘤细胞的扩散和转移。本研究为今后膀胱癌的临床治疗提供了新方向，而miR-429很可能作为膀胱癌临床治疗的新靶点。

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2017-10-11)