成人正常核型原发急性髓系白血病中TET2突变情况及临床意义

李佳佳，朱俊锋，周黎黎，朱凯，张凤，孙自敏，张竞竞

(1蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000;2安徽医科大学附属省立医院)

成人正常核型原发急性髓系白血病中TET2突变情况及临床意义

李佳佳1，朱俊锋1，周黎黎1，朱凯1，张凤1，孙自敏2，张竞竞1

(1蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000;2安徽医科大学附属省立医院)

目的探讨成人正常核型原发急性髓系白血病(AML)患者中TET2突变情况及其临床意义。方法收集98例成人正常核型原发AML患者的骨髓标本，PCR扩增目的片段，然后进行直接测序检测TET2突变情况，并探讨TET2突变与AML患者临床特征、疗效及生存率的关系。结果23例AML患者出现TET2突变，且突变的白血病类型多为M2、M5型；与TET2野生型AML患者相比，TET2突变患者骨髓原始细胞、白细胞计数高，血小板计数低(P均<0.05)，且TET2突变型患者具有较短的总生存期；TET2突变型患者的年龄、性别、血红蛋白、化疗方案、化疗疗效、危险分层、FLT3-ITD和NPM1 突变与TET2野生型患者相比差异均无统计学意义(P均>0．05)。结论成人正常核型原发AML患者中TET2突变发生率较高，与其预后差有关。

急性髓系白血病；TET2 突变；预后；成年人

急性髓系白血病(AML)是一种生物反应高度异质性血液系统肿瘤，它的临床表现具有较大的差异。预后分层是确定AML治疗方案的重要手段。预后中等组大多具有正常核型，占AML患者50%左右。最近，欧洲白血病网络(ELN)已证实，FLT3、NPM1及 CEBPA突变对预后有显著影响，并纳入风险分层。最新的研究中发现，如果AML中出现DNMT3A突变、IDH1/2、WT1基因突变、RUNX1基因及KIT突变提示AML预后不良[1～6]。TET2基因已经成为国内外研究的热门课题，在体内可以促进DNA的去甲基化;TET2突变可以促进启动子的甲基化，从而导致造血干细胞的异常增殖和分化，形成肿瘤[7]。现在已经发现，TET2突变出现在慢性粒单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征(DMS)等疾病中[7]。但是TET2在AML中的意义尚不明确，因此，在本研究中，我们观察了98例成人原发急性AML患者发生TET2突变的情况，并探讨其突变患者的临床特征、化疗敏感度、生存时间等，从而为AML预后分层提供一定的参考意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年8月～2015年5月成人原发急性AML非M3患者98例，男60例、女44例，年龄18～68岁、平均44岁。患者均经过骨髓细胞形态学(FAB分类标准)、免疫表型、染色体和融合基因检查确诊。染色体检测为正常核型。

1.2 治疗方法 <60岁AML患者进行标准的“3+7”方案的初始诱导治疗(柔红霉素/伊达比星+阿糖胞苷)。≥60岁老年患者，使用CAG(阿糖胞苷+阿糖胞苷+粒细胞集落刺激因子)的预激方案治疗。28 d进行骨髓穿刺对化疗反应进行评估。所有参与的患者在化疗前给予书面知情同意书。疗效标准：完全缓解(CR)：①临床无白血病细胞浸润所致的症状和体征，生活正常或接近正常。②血象：Hb≥100 g/L(男)，或≥90 g/L(女)，中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L。外周血白细胞分类中无白血病细胞。③骨髓象：原始细胞+幼稚细胞≤5%。部分缓解(PR)：骨髓原始细胞+幼稚细胞>5%～20%；或临床、血象中有一项未达完全缓解标准者。未缓解(NR)：骨髓原始细胞+幼稚细胞>20%。总生存期(OS)是从诊断到任何原因死亡的时间长度。对于无复发或死亡事件的患者随访研究，生存终点均为最后一次随访时间。

1.3 TET2基因突变的检测 DNA抽提：抽取患者骨髓标本提取骨髓单个核细胞1.0×107个,用DNA 抽提试剂盒(上海申友公司产品)提取基因组 DNA。使用紫外分光光度仪测定吸光度A260nm /A280nm 值，确定产物DNA的浓度，然后使用去离子水稀释基因组 DNA 样品至 100 ng/μL。于-80 ℃冰箱保存。PCR反应：TET2 野生型PCR 引物序列：F：5′-ACGCTTGGAAGCAGGAGAT-3′；R：5′-CACAAGGCTGCCCTCTAGTT-3′；通过普通 PCR 扩增 TET2基因，PCR反应条件：PCR 体系为 MIX 20 μL，ddH2O 16 μL， 引物 2 μL和 DNA 模板2 μL。PCR 程序为 94 ℃ 预变性 3 min， 然后 94 ℃ 变性 30 s， 58 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 1 min， 34 个循环， 最后 72 ℃ 延伸 10 min。基因测序：将患者PCR 产物直接送至北京海思特临床检验所或者天津血液病研究所进行二代测序，行FLT-3、NPM1、CEBPA、TET2基因突变检测。用 Chromas 软件分析测序结果。根据序列分析结果显示的TET2 野生型 cDNA (GenBank Accessionnum ,NC_000004.12 )，确定患者TET2突变类型。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以中位数表示，比较采用秩和检验；计数资料以频次或百分比表示，比较采用χ2检验。生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，比较采用Log-Rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原发急性AML患者中TET2基因的突变率 98例AML患者23例TET2编码序列出现改变，突变最常出现的是外显子部位蛋白的突变蛋白，12例突变出现于3号外显子，3例于6号外显子，2 例于7 号外显子，6例于11号外显子，突变发生率为23.47%(23/98)。

2.2 TET2突变与原发急性AML患者临床和分子生物学特征之间的关系 98例原发急性AML患者按照TET2是否突变分为TET2突变组和TET2野生组。TET2突变组患者23例，男13例、女10例；<60岁18例，≥60岁5例；白细胞计数60.26×109/L(0.4×109/L～230×109/L)，血红蛋白80.48 g/L(37～128 g/L), 血小板计数55.61×109/L(5×109/L～154×109/L)，骨髓原始细胞67.28%(10%～95%)；同时出现FLT-ITD突变者5例，无FLT-ITD突变者18例；同时出现NPM1突变者7例，无NPM1突变者16例。TET2野生组75例，男43例、女32例；<60岁64例，≥60岁11例；白细胞计数52.10×109/L(0.69×109/L～364.62×109/L)，血红蛋白73.87 g/L(35～122 g/L), 血小板计数52.09×109/L(5×109/L～419×109/L)，骨髓原始细胞63.25%(20%～99%)；同时出现FLT-ITD突变者26例，无FLT-ITD突变者49例；同时出现NPM1突变者28例，无NPM1突变者47例。两组年龄、血红蛋白数、FLT-ITP突变、NPM1突变等比较，P均>0.05。与TET2野生组相比，TET2突变组骨髓原始细胞、白细胞计数高，血小板计数低(P均<0.05)，TET2突变组男性患者比例高于TET2野生组(P<0.01)。FAB分类中，TET2突变多发生在M2(7/23，30.53%)及M5(10/23,43.48%)。

2.3 TET2突变与原发AML患者化疗疗效之间的关系 随访终点为2015年5月31日或患者死亡时，中位随访时间 354 d(生存时间为13～1 632 d)。TET2突变组使用IA方案化疗12例，DA方案化疗6例，CAG方案化疗5例；化疗后CR 8例,PR 12例,NR 3例；OS均值为552 d。TET2野生组使用IA方案化疗41例，DA方案化疗23例，CAG方案化疗11例；化疗后CR 39例,PR 23例,NR 13例；OS均值396 d。两组化疗方案选择及化疗疗效比较，P均>0.05。与TET2野生组相比，TET2突变组患者具有较短的OS(P=0.04)，但CR率高。

图1 TET2野生型与突变型患者的生存曲线

2.4 TET2突变与AML患者NCCN预后危险分组之间的关系 根据AML患者的细胞遗传学危险分层标准[1]，可以将AML分为预后良好、预后中等、预后不良三组；伴有inv(16)/t(16;16), t(8;21) 及 t(15;17)的AML为预后良好组；复杂核型, t(6;9), inv(3)/t(3;3),-5/del(5q)及-7/del(7q)视为预后不良组，其他为预后中等组。根据NCCN危险分组，98例AML患者中，低危组35例，CR 28例，OS 746 d；中危组31例，CR 11例，OS 463 d；高危组32例，CR 8例，OS 263 d。原发AML患者在低危组具有更长的OS，更高的CR率(P均<0.05)。98例原发AML患者中，低危组35例，TET2突变为7例；中危组31例，TET2突变为10例；高危组32例，TET2突变为6例。3组TET2突变发生率比较，P>0.05。

3 讨论

以往的研究多分析TET2基因突变对MDS、骨髓增殖性肿瘤及继发性AML的影响[7,8]。很少报道TET2突变与原发AML之间的关系及在临床中的意义。文献[9,10]报道，原发性AML患者TET2突变为17%和19%。本研究中在原发AML患者中TET2基因突变发生率为23.47%，可能与实验中无68岁以上的AML患者有关，因为在其他试验中发现TET2突变更易出现在中年患者。本试验着眼于原发AML患者是因为现在越来越多的基因突变被应用于原发AML预测预后和分层治疗[11～15]。我国正常核型的原发AML病例最为常见，发病率高达AML患者的45%，因此我们将研究对象定位为正常核型原发AML。本实验发现，TET2基因突变与性别有关，男性TET2突变率更高，与文献[15]报道一致；并且与高白细胞计数、低血小板计数及骨髓原始细胞数相关，提示TET2突变与预后不良有关。 Nibourel等[9]在研究TET2基因突变对原发AML患者预后的影响中发现，AML患者化疗达到CR后，预后良好组与预后不良者的患者无病生存期与OS差异无统计学意义。在另一项研究[7]中，原发性或继发性AML患者，出现TET2突变，会出现低OS。随着越来越多的基因突变在原发AML被确定，分子遗传学层面单基因的突变在AML预后预测中变得越来越重要。一个基因突变对于预后的影响可能取决于其他分子标志物存在或缺乏(如NPM1突变是有利的结果，特别FLT-ITD缺乏的情况下)。因此在制定相应的治疗方案前进行一系列基因标记的检测，从而确定危险分层是必不可少的。

按照NCCN分类方法，原发AML患者被分为三类：低危组(NPM1突变无FLT3-ITD或CEBPA突变)、中危组(所有剩余的CN-AML患者)及高危组(正常细胞遗传学伴FLT-ITD突变)。为了检验TET2基因突变是否可用于这个被广泛接受的分类方法，我们研究了其在按照NCCN风险分类的原发AML中的预后评估价值。低危组患者，如果出现TET2基因突变，与野生型TET2患者相比，具有较低的CR率，并有较高的死亡风险。提示TET2(可能WT1)突变可作为CN-AML分类方案的候选标志物。

总之，TET2突变在成人原发性CN-AML患者的发生率在20%以上，对于改进遗传风险的分类方案是有意义的，尤其是预后分类。目前NCCN指南一般不建议预后良好组AML患者在第一次CR后进行骨髓移植治疗。本研究结果表明，这些患者若出现TET2突变，如使用传统的缓解后治疗，即按照AML治疗指南进行多疗程化疗可能效果不佳。提示如果患者出现TET2突变尽早应该进行临床研究及骨髓移植。

本研究中缺乏70岁以上AML患者，此类患者具有骨髓增生低下、疾病发展相对缓慢、低白细胞的特点，使用地西他滨+CAG方案化疗疗效好。但是由于本地区经济相对落后，此类AML患者多不能坚持足疗程化疗，病例数较少，希望在以后的工作中能积累更多此类AML患者，研究TET2突变在此群组中的临床意义。

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TET2mutationanditsclinicalsignificanceinadultnormalkaryotypeacutemyeloidleukemia

LIJiajia1,ZHUJunfeng,ZHOULili,ZHUKai,ZHANGFeng,SUNZimin,ZHANGJingjing

(1TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China)

ObjectiveTo investigate the TET2 mutation and its significance in patients with acute myeloid leukemia (AML).MethodsThe bone marrow samples from 98 patients with newly diagnosed AML were collected. The target fragments were amplified by polymerase chain reaction (PCR). Then, TET2 mutations were detected by direct sequencing, and we explored the relationships between the TET2 mutation and the clinical features, efficacy, and survival rate of AML patients.ResultsTwenty-three patients had TET2 mutations (23.46%). M2 and M5 were the main mutant types.Comparedwith the TET2 wild type group, the number of primitive cells, peripheral blood leukocyte count, and blood platelet count were lower in the TET2 mutant group (allP<0.05), and the TET2 mutant patients had a poor overall survival rate. No significant difference was found in the age, sex, hemoglobin, chemotherapy regimen, chemotherapy efficacy, risk stratification, FLT3-ITD, and NPM1 mutations between the TET2 wild type group and TET2 mutant group (allP>0.05).ConclusionThe incidence rate of TET2 mutation is higher in AML patients, which is related to the poor prognosis of patients.

acute myeloid leukemia; TET2 mutation; prognosis; adults

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.005

R733.7

A

1002-266X(2017)45-0016-04

安徽省高等学校自然科学研究一般项目(KJ2015B88by)；蚌埠医学院院级课题基金(BYKY1470)。

李佳佳(1983-)，女，硕士，主要从事血液病的诊治研究。E-mail:4119469@qq.com

张竞竞(1981-)，女，讲师，主要从事血液肿瘤学研究。E-mail:zjjahbb@163.com

2017-09-18)