食管鳞状细胞癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c、VEGF-A表达变化及其相关性

宋雷雷，徐广峰，谢晖，张乃键，邵启祥

(1江苏大学医学院，江苏镇江212013；2中国人民解放军第82医院)

·论著·

食管鳞状细胞癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c、VEGF-A表达变化及其相关性

宋雷雷1，2，徐广峰2，谢晖2，张乃键2，邵启祥1

(1江苏大学医学院，江苏镇江212013；2中国人民解放军第82医院)

目的观察食管鳞状细胞癌(ESCC)癌组织及癌旁组织中miRNA-29家族(miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c)及血管内皮生长因子A(VEGF-A)的相对表达量变化，并探讨他们之间的关系。方法收集手术切除并经病理检查确诊的ESCC癌组织及癌旁组织，应用qRT-PCR及免疫组织化学染色技术分别检测miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c、VEGF-A的相对表达量，并分析其相关关系；进一步应用生物信息学方法和双荧光素酶报告基因系统推测和验证miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同调控同一靶基因VEGF-A的分子调节机制。结果与癌旁组织比较，ESCC癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c呈低表达(P均<0.05)；VEGF-A呈高表达(P<0.05)，且其之间呈负相关关系(miRNA-29a：r=-0.955；miRNA-29b：r=-0.950；miRNA-29c：r=-0.893，P均<0.01)。生物信息学分析结果发现，VEGF-A能够与miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c进行特异性结合，可能为miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因。双荧光素酶报告基因系统验证了VEGF-A是miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因。结论ESCC癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c低表达，VEGF-A高表达；且他们之间具有负相关关系。VEGF-A为miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶向调节基因。

食管鳞状细胞癌；微小RNA-29a；微小RNA-29b；微小RNA-29c;血管内皮生长因子A

食管鳞状细胞癌(ESCC)是我国最常见恶性肿瘤[1]。ESCC具有高度转移和侵袭性特点，其5年存活率仅为18%[2]。现阶段，关于ESCC发生发展过程中的具体分子调节机制尚未明确。近年，大量研究表明，微小RNA(miRNA)作为一类含有18～25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA在ESCC的发生发展过程中发挥了重要调节作用。随着miRNA研究的不断深入，研究人员发现异常表达的miRNA可以导致下游靶基因的异常表达可能是ESCC疾病重要的调节机制。2015年5月～2016年5月，本研究通过检测ESCC癌组织及癌旁组织中miRNA-29家族(miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c)、VEGF-A的相对表达量变化情况，分析其之间的相关关系。然后进一步应用生物信息学分析方法和实验技术对miRNA-29家族可以共同调控靶基因VEGF-A这一分子调节机制进行了推测与实验验证。

1 材料与方法

1.1 细胞、组织、试剂、仪器及其来源 细胞系HEK-293T购自中科院上海细胞库。ESCC患者的癌组织及癌旁组织各55例份，患者中男35例、女20例，年龄30～80岁。根据世界卫生组织和国际抗癌联盟的标准，高分化22例份、中分化28例份、低分化5例份；Ⅰ～Ⅱ期18例份、Ⅲ～Ⅳ期37例份；有淋巴结转移42例份、无淋巴结转移13例份。组织化学染色试剂购自北京中杉金桥公司；has-miR-29a、miRNA-29b、miRNA-29c引物和载体(psiCHECK-2)购自美国Sigma公司；荧光定量PCR仪(ABI7500)购自美国Applied Biosystems 公司。

1.2 ESCC癌组织及癌旁组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c表达的检测 首先选取3组配对的ESCC样本进行预实验，应用微阵列芯片检测技术筛选ESCC癌组织及癌旁组织中具有显著差异性表达的miRNAs。应用qRT-PCR验证，所有操作严格按说明书进行，并以U6为内参照，实验重复3次，取平均值。采用U6来校对样本中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相对表达量。以2-ΔΔCt计算miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相对表达量。ΔCt=miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的Ct值-U6的Ct值，ΔΔCt=癌组织ΔCt-癌旁组织ΔCt。

1.3 ESCC癌组织及癌旁组织中VEGF-A mRNA及蛋白相对表达量的检测 分别采用qRT-PCR法和免疫组织化学染色法。qRT-PCR法：所有操作严格按照说明书进行，并以U6为内参照，实验重复3次，取平均值，以2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。免疫组织化学染色法：石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2室温孵育；抗原微波热修复，5%～10%正常山羊血清封闭非特异性位点；倾去血清，滴加VEGF-A一抗工作液，37 ℃孵育过夜；滴加生物素标记的二抗工作液和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液；DAB染色，苏木素复染细胞核，封片，用中山桥公司提供的已知大肠癌阳性标本作为阳性对照；以PBS代替一抗作为阴性对照，所有操作严格按照说明书进行。结果判断：VEGF-A蛋白阳性表达定位于细胞膜或细胞质内，呈棕黄色颗粒。在低倍镜(40倍)下选取阳性细胞最密集区域，然后在100倍视野下计数1 000个细胞，计算阳性细胞占肿瘤细胞的百分率，在高倍镜下(400倍)观察细胞染色程度、定位及形态。不着色计为阴性(-)，阳性细胞数< 25%计为弱阳性(+)，25%～50%计为阳性表达(+ +)，>50%计为强阳性(+ + +)。具体实验步骤及结果判断由两位临床病理医生操作及按双盲法进行计数，计数差异超过10%，需重新计数。

1.4 miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同靶基因的预测分析 应用 mirtarbase数据库(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)筛选miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因。应用STRING蛋白质相互作用数据库(http://string-db.org/)构建蛋白质相互作用网络。应用DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcff.gov/home.jsp)进行信号转导通路的富集分析。

1.5 miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c与VEGF-A靶向关系的验证 采用双荧光素酶试验。将HEK-293细胞接种在96孔板中，培养24 h后，分别共转染质粒、VEGF-A野生型3′-UTR(未突变组)、VEGF-A突变型3′-UTR(突变组)。细胞培养48 h后，应用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega公司)测量萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，实验检测结果用相对荧光素酶活性表示。计算公式：相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，每组实验重复3次。

2 结果

2.1 ESCC癌组织及癌旁组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相对表达量 ESCC癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相对表达量分别为0.83±0.049、0.69±0.280、0.42±0.140，癌旁组织中分别为0.98±0.011、0.96±0.008、0.94±0.014。与癌旁组织比较，ESCC癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相对表达量低(P均<0.05)，与预实验里的芯片筛选结果一致。

2.2 ESCC癌组织及癌旁组织中VEGF-A的相对表达量比较 ESCC癌组织与癌旁组织中VEGF-A mRNA的相对表达量分别为4.84±0.152、0.98±0.012。ESCC癌组织中VEGF-A mRNA的相对表达量高于癌旁组织(P<0.05)。VEGF-A免疫组化阳性表达主要位于细胞质，部分表达于细胞膜，阳性表达为棕黄色颗粒。55例份ESCC癌组织中， VEGF-A染色阳性39例份，阳性率为70.9%。55例ESCC癌旁组织中， VEGF-A染色阳性9例，阳性率为16.4%。ESCC癌组织中的VEGF-A阳性率高于癌旁组织(P<0.05)。

2.3 ESCC癌组织中VEGF-A与miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相关性 VEGF-A mRNA的相对表达量与miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的相对表达量呈负相关(miRNA-29a：r=-0.955；miRNA-29b：r=-0.950；miRNA-29c：r=-0.893，P均<0.05)。

2.4 miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同靶基因的预测分析 miRNA-29a靶基因97个，miRNA-29b靶基因88个，miRNA-29c靶基因66个，三者取交集得到它们共同的靶基因42个。富集分析结果发现：VEGF-A位于所构建网络的中心位置，参与了多数网络途径的调节过程。miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同靶基因的信号调节通路显著富集于黏着斑、PI3K-AKT、癌症、小细胞肺癌等信号通路；VEGF-A参与其中的黏着斑、PI3K-AKT、癌症、癌症miRNAs信号调节通路途径。

2.5 miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c与VEGF-A的靶向关系 生物信息学分析发现,VEGF-A的3′非翻译区的序列(TGGTGCT)与miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c的序列之间可以进行互补结合。突变组和未突变组中miRNA-29a荧光素酶活性分别为0.978±0.056，0.549±0.097；miRNA-29b分别为0.967±0.075，0.675±0.086；miRNA-29c分别为0.975±0.081，0.732±0.092。与未突变组比较，突变组miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c荧光素酶活性升高(P均<0.01)。

3 讨论

miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b-1、miRNA-29b-2、miRNA-29c，各家族成员之间具有相似的种子序列。其中miRNA-29a和miRNA-29b-1基因位于染色体7q3.2；miRNA-29b-2、miRNA-29c位于染色体1q3.2[3]。在肿瘤疾病中，miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c既可作为致癌基因也可作为抑癌基因而发挥重要的调控作用。已有研究表明，在多数肿瘤疾病中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c呈现出低表达现象，其可以通过抑制其靶基因的途径，而作为抑癌基因抑制肿瘤细胞的转移和浸润，如恶性胶质瘤[4]、前列腺癌[5]、肾癌[6]、套细胞淋巴瘤[7]、鼻咽癌[8]等。但同时也有相关研究表明，在少数肿瘤疾病中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c又可作为致癌基因，呈现出高表达的现象，如乳腺癌[9]、恶性胸膜间皮瘤[10]、弥漫性大B淋巴瘤[11]。本研究结果发现，在ESCC癌组织中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c呈现出低表达的现象。由此我们推测，在ESCC的发生发展过程miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c可能作为抑癌基因发挥抑制癌症的作用。但现阶段，在ESCC疾病过程中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c发挥作用的具体分子机制尚未见详细报道。

近年来，生物信息学方法已经广泛地应用于miRNA相关分子调节机制的研究。为进一步深入探讨在ESCC疾病中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c具体的分子调节机制，我们采用生物信息学分析方法，通过在线miRNA靶基因预测软件对人miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因进行了预测，并对其共同的靶基因进行功能富集分析。研究结果发现miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因在功能方面主要集中在细胞基质黏附调节、蛋白质的细胞外基质、器官的形态发生、血管发育途径等方面；在信号调节途径方面主要集中于癌症miRNAs、黏着斑、PI3K-Akt等信号调节途径。与此同时，我们发现VEGF-A作为miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的预测靶基因参与了多条信号调节途径。据此我们推断VEGF-A可能是miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因。

VEGF-A是一类血管内皮生长刺激因子，具有促进血管形成和再生的功能。研究表明，在肿瘤疾病的发生发展过程中，VEGF-A能促进内皮细胞增殖，增加血管通透性，促进新血管形成，从而促进肿瘤细胞的侵袭及转移。VEGF-A能够通过其受体VEGFR-1和VEGFR-2促进肿瘤细胞增殖、转移及淋巴管生成[12]。已有研究表明，VEGF-A在多种肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，如肾癌[13]、肺癌[14]、食管癌。然而，目前为止，关于miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c与VEGF-A参与ESCC疾病发生发展的相关性研究尚未见报道。本实验结果表明，在ESCC癌组织中VEGF-A呈现出高表达。同时我们也发现，miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c与VEGF-A的相对表达量之间存在负相关关系。我们进一步应用双荧光素酶试验证明了VEGF-A的3′非翻译区能够特异性与miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c结合，是其共同的靶基因。以上实验结果表明，在ESCC疾病中miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c能够与VEGF-A的3′非翻译区进行特异性结合，从而共同调控同一靶基因VEGF-A的表达，参与调节多条涉及VEGF-A的信号调节途径，最终影响ESCC的发生发展。

综上所述，在ESCC癌组织中，同时存在低表达量的miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c和高表达量的VEGF-A，且它们之间存在负相关关系，VEGF-A是miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c共同的靶基因。本研究首次阐明了ESCC中miR-29a、miRNA-29b、miRNA-29c-VEGF-A分子调节机制，为ESCC的诊断和治疗提供了新的思路和线索。

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ExpressionchangesofmiRNA-29a/b/candVEGF-Ainesophagealsquamouscellcarcinomaandthecorrelationsbetweenthem

SONGLeilei1,XUGuangfeng,XIEHui,ZHANGNaijian,SHAOQixiang

(1SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

ObjectiveTo observe the expression changes of miRNA-29 family (miRNA-29a, miRNA-29b, and miRNA-29c) and vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) in the esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissues and to investigate the relationships between them.MethodsThe expression levels of miRNA-29a/b/c and VEGF-A were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry (IHC), respectively, in the ESCC tissues and para-carcinoma tissues. The relationship between the expression of miRNA-29a/b/c and VEGF-A was further analyzed. We used the bioinformatics method and dual luciferase reporter gene system experiment to predict and verify that miRNA-29a/b/c could co-regulate the same target gene VEGF-A.ResultsThe higher expression of VEGF-A and the lower expression of miRNA-29a/b/c were detected in the ESCC tissues as compared with that of the para-carcinoma tissues. There was a significant negative correlation between the expression levels of miRNA-29a/b/c and VEGF-A in ESCC tissues (miRNA-29a:r=-0.955, miRNA-29b:r=-0.950, miRNA-29c:r=-0.893; allP<0.01). Bioinformatics analysis showed that VEGF-A could specifically bind with miRNA-29a/b/c, which could be the common target gene of miRNA-29a/b/c. The dual luciferase reporter system validated that VEGF-A was a common target gene of miRNA-29a/b/c.ConclusionsThe miRNA-29a/b/c is low expressed, and VEGF-A is highly expressed in the ESCC tissues, and they are negatively correlated with each other. VEGF-A is a common target regulator gene of miRNA-29a/b/c.

esophageal squamous cell carcinoma; miRNA-29a; miRNA-29b; miRNA-29c; vascular endothelial growth factor-A

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.001

R735.1

A

1002-266X(2017)45-0001-04

国家自然科学基金资助项目(81600689)。

宋雷雷(1984-)，男，主管技师，主要从事食管癌分子机制的相关研究。E-mail：songleileiyouxiang@163.com

邵启祥(1965-)，男，教授，博士生导师，主要从事免疫调节与移植免疫的相关研究。E-mail：shao_qx@ujs.edu.cn

2017-04-20)