健脾清肠方联合骨化三醇对溃疡性结肠炎大鼠白细胞介素—17和干扰素—γ表达的影响

卢璐 袁建业 费晓燕 卞慧 林江

摘要：目的 观察健脾清肠方联合骨化三醇对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜白细胞介素-17（IL-17）和干扰素-γ（IFN-γ）表达的影响，探讨其作用机制。方法 实验大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、骨化三醇组、健脾清肠方+骨化三醇组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠予三硝基苯磺酸灌肠造模。造模后第3日大鼠开始给药，开始给药后第11日称重后处死。期间计算疾病活动指数（DAI），光镜下按结肠组织病理学评分（HPS）评估大鼠结肠黏膜损伤程度。采用RT-PCR和免疫组化方法检测结肠黏膜IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表达。结果 模型组DAI及HPS明显高于正常组（P<0.01）；与模型组比较，各给药组DAI及HPS显著降低（P<0.05，P<0.01），美沙拉嗪组和健脾清肠方+骨化三醇组大鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表达明显降低（P<0.01）。结论 健脾清肠方联合骨化三醇可能通过调节大鼠辅助T淋巴细胞17细胞，下调IL-17表达，降低免疫细胞活性，减少炎性细胞分泌，减轻结肠黏膜的损伤。

关键词：健脾清肠方；骨化三醇；溃疡性结肠炎；干扰素-γ；白细胞介素-17；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.009

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0036-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Jianpi Qingchang Decoction combined with Calcitriol on the expressions of IL-17 and IFN-γ in colitis in rats with ulcerative colitis； To discuss the mechanism of action. Methods Experimental rats were randomly divided into control group， model group， Mesalazine group， Calcitriol group， Jianpi Qingchang Decoction + Calcitriol group， with 10 rats in each group. Except for the control group， other groups were given TNBs for modeling. The administration began on the 3rd day after modeling. All rats were weighed and sacrificed on the 11th day after administration. The disease activity index （DAI） were calculated and the colon histopathological （HPS） were evaluated under microscope. The mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17 in colonic mucosa were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the control group， the DAI and HPS of the model group increased significantly （P<0.01）； Compared with the model group， the DAI and HPS of administration groups were reduced significantly （P<0.05， P<0.01）， and the mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17 in Mesalazine group and Jianpi Qingchang Decoction + Calcitriol group decreased significantly （P<0.01）. Conclusion Jianpi Qingchang Decoction combined with Calcitriol can down-regulate IL-17 expression， decrease the activity of immune cells， reduce the secretion of inflammatory cells， and lessen the damage of colonic mucosa by regulating Th17 cells.

Keywords： Jianpi Qingchang Decoction； Calcitriol； ulcerative colitis； IFN-γ； IL-17； rats

潰疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是指局限于结肠黏膜层的非特异性溃疡性病变。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液血便、发热、贫血等，可并发中毒性肠扩张、肠出血、肠穿孔。研究显示，UC患者普遍存在维生素D缺乏[1-2]。体外实验表明，VitD缺乏的CD4+T细胞过量产生白细胞介素-17（IL-17）和干扰素-γ（IFN-γ），而活性VitD3可抑制辅助T淋巴细胞17（Th17）细胞，从而改善Th17细胞所介导的炎症反应[3]。本课题组针对UC脾气亏虚、湿毒蕴结的病机关键，自拟健脾清肠方用于临床，疗效较好。本实验观察健脾清肠方联合骨化三醇对三硝基苯磺酸（TNBs）诱导UC大鼠IL-17、IFN-γ的影响，从细胞层面探讨中药及维生素D对UC的免疫调节机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠50只，体质量（200±20）g，上海中医药大学实验动物中心。饲养于昼夜光线变化、恒湿、恒温环境，自由摄食饮水，实验前适应性饲养1周。

1.2 药物

健脾清腸方颗粒（党参15 g，黄芪30 g，黄连6 g，马齿苋30 g，地榆15 g，白及3 g，三七6 g，木香9 g，甘草6 g），上海中医药大学附属龙华医院中药房提供。美沙拉嗪肠溶片，0.25 g/粒，葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，批号111206；骨化三醇胶丸，0.25 μg/粒，瑞士上海罗氏制药有限公司，批号H20150127。

1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥（上海西唐生物），TNBs原液（德国Sigma），兔抗IFN-γ、兔抗IL-17及即用型SABC免疫组化染色试剂盒（北京博奥森生物），FQ-PCR试剂盒（上海达为科生物）。显微镜（日本OLYMPUS），PCR仪（加拿大Funglyn Biotech），Powerlab数据分析系统（澳大利亚ADInstruments）。

2 实验方法

2.1 分组及造模

50只大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、骨化三醇组和健脾清肠方+骨化三醇组，每组10只。除正常组外，其余4组大鼠均予戊巴比妥钠麻醉后予TNBs灌肠法造模[4]。造模后每日观察并记录大鼠大便数量、性状及体质量、精神活动等。

2.2 给药

大鼠造模后第3日，除模型组外，其余各组大鼠给予1.0 mL/200 g体质量灌胃，每日1次，连续10 d。正常组予蒸馏水灌胃；骨化三醇组用无菌大豆油将骨化三醇胶丸中液体稀释，配制成浓度为1 μg/mL混悬液灌胃[5-6]；健脾清肠方+骨化三醇组将健脾清肠颗粒剂加蒸馏水配制成196.9 mg/mL溶液与1 μg/mL骨化三醇混悬液充分混合后灌胃；美沙拉嗪组将美沙拉嗪肠溶片研磨成细粉，加入蒸馏水配制成112 mg/mL混悬液灌胃。药物用量按照人和动物间体表面积折算等效剂量比值表[7]计算。

2.3 标本采集

各组大鼠给药后第11日称重并处死，迅速剖取自肛门往上至8 cm的结肠，生理盐水冲洗干净，将结肠黏膜层向上置于白色卡纸上，肉眼观察结肠黏膜急性损伤程度。随后挑取黏膜破损最为显著处病变肠段，沿纵轴切开，分为2部分，一部分于10%甲醛中固定，剩余标本装入Eppendorf管后，-80 ℃冰箱保存，分别行病理、免疫组化及RT-PCR检测。

2.4 大鼠疾病活动指数及结肠组织病理学评分

造模后每日大鼠称重，观察大鼠活动及大便数量和性状，计算疾病活动指数（disease activity index，DAI）[8]。常规HE染色后，光镜下按结肠组织病理学评分（histopathological score，HPS）评估UC大鼠结肠黏膜损伤程度[9]。

2.5 免疫组化检测结肠黏膜白细胞介素-17和干扰素-γ蛋白表达

结肠组织经切片、烤片、脱蜡、水化及热抗原修复后，滴加IFN-γ、IL-17一抗（工作浓度均为1∶100）， 4 ℃过夜，PBS洗2 min×3次。滴加二抗37 ℃ 20 min；PBS洗2 min×4次。滴加3抗后置恒温箱37 ℃ 20 min。PBS洗5 min×4次，标本置于PBS。加入DAB显色液（先抽吸1 mL蒸馏水，再加入DAB显色液各1滴），加20 ?L至标本上完全覆盖，显色5 min后，用蒸馏水冲洗，复染后乙醇由低至高浓度逐级脱水，加入二甲苯后封片，镜检。每张切片随机选定3个视野（×200），运用医学图像定量分析系统对免疫组化图像中阳性区域面积及光密度（OD）值进行测定，计算免疫组化指数（IHC）。IHC=阳性面积×OD值÷总面积。

2.6 RT-PCR检测结肠黏膜白细胞介素-17和干扰素-γ基因表达

取结肠组织提取总RNA，移至5 mL玻璃试管中，每一试管加入1 mL预冷Trizol，匀浆。每个标本处理后棉球擦拭，DEPC处理水清洗；依次将匀浆液转至1.5 mL Eppendorf管。各管中加200 μL氯仿，振荡摇匀15 s；4℃、12 000 r/min离心15 min；吸出水层加至Eppendorf管，再加二倍体积异丙醇（约600 μL），混匀，置于-20 ℃冰箱30 min；4 ℃、10 000 r/min离心15 min。弃上清液留沉淀；用650 μL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、8000 r/min离心5 min，弃上清液留沉淀；打开管盖，65 ℃干式恒温器烘干5～10 min。20 μL DEPC处理水，溶解RNA，-20 ℃冰箱保存待用。反转录制备cDNA，将制备好cDNA进行PCR扩增，并运用Prism7500软件（上海生工）设计并合成引物，最后采用相对定量，比较管家基因（GAPDH）与目的基因的Ct值，得出所测标本目的基因相对表达量。相对mRNA表达=2-ΔCt×100%，ΔCt值=Ct值靶基因-Ct值GAPDH。

3 统计学方法

采用Graphpad Prism5.0统计软件进行分析。实验数据以x±s表示，组间比较用Student's t检验，多组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

造模后第1日大鼠大便次数逐渐增多，粪质稀软；造模后第3日症状达到高峰，90%大鼠出现黏液脓血便，并且嗜卧扎堆、毛色无华；给药第10日模型组大鼠仍有黏液血便而健脾清肠方+骨化三醇组大鼠粪便尚不成形，但黏液脓血基本消失；美沙拉嗪组大鼠无黏液脓血便且大便多数成形，偶见软便。

4.2 疾病活动指数和病理学评分比较