美国梾木引种栽培果实落果生理生化分析研究

陈景震，何小芳，唐 竑，夏 栗，李培旺

（1. 湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004； 2. 新余市林业产业发展管理局，江西 新余 338000；3. 湖南省农林工业勘察设计研究总院，湖南 长沙 410007）

美国梾木引种栽培果实落果生理生化分析研究

陈景震1，何小芳2，唐 竑2，夏 栗3，李培旺1

（1. 湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004； 2. 新余市林业产业发展管理局，江西 新余 338000；3. 湖南省农林工业勘察设计研究总院，湖南 长沙 410007）

为了探明美国梾木引种栽培果实落果致败诱因，以不同发育阶段美国梾木果实为对象，采用实验室常规化学成分分析法、紫外分光光度法及色谱分析法等技术手段对果实发育过程各生理生化指标进行测定。结果表明：在逆境或衰老条件下，果实内可溶性糖含量是持续增长的，递增量 0.67 mg/g，蛋白质含量在果实发育初期递增明显，平均递增量为 0.6 mg/g，6 月初开始下降呈抛物线变化后趋于稳定保持在 1.14 mg/g，还原糖由于可能出现的呼吸骤变，含量持续增加，递增量为 8.63 mg/g，淀粉含量在发育初期达到 2.28 mg/g 后急剧下降，从在 6 月初至落果前保持稳定，最终含量保持在 1.96 mg/g；果实中过氧化氢活性在发育初期最强，达到 0.018△OD/min·mg，6 月底至 7 月初活性降至最低点，6 月至 7 月突然出现的高温高湿气候导致果实发育受到影响，表现为对逆境的不适应过氧化氢酶活性；果实内源激素中细胞分裂素（ZT）和生长素（IAA）一直持续下降，降幅分别为 109.68 μg/g和 38.97 μg/g，赤霉素（GA）呈现抛物线变化，平均递减幅度 5.89 μg/g，落果前呈小幅度的增长，平均递增量 3.79 μg/g，脱落酸（ABA）含量急剧降低持续到 6 月中上旬，平均递减量 3.06 μg/g，在落果之前脱落酸（ABA）含量基本趋于稳定，ABA/ZT 变化稳定，ABA/GA 变化呈整体下降趋势，ABA/IAA 变化呈缓慢增长趋势，脱落酸（ABA）占据主导地位导致落果；通过相关性分析，可溶性糖变化与还原糖变化呈极显著相关，与生长素（IAA）变化呈负极显著相关，可溶性糖含量增加，果实生长变慢，能耗过快，成为果实落果的诱因。

美国梾木；落果；内含物；过氧化氢酶活性；内源激素

美国梾木（Cornus spp.），山茱萸科梾木属，为落叶灌木或小乔木，原产美国马萨诸塞州至佛罗里达州、堪萨斯州，墨西哥也有分布。单叶对生，椭圆形，花黄绿色，头状花序，白色总苞片 4 个，花期 4-5 月，核果，卵圆形，长度0.8 cm-1.3 cm，成熟期 9-10 月［1］。由于美国梾木经济性状表现优良（灌木或小乔木，果实较大等），为了丰富湖南省梾木属植物种类多样性，引种到湖南省长沙市，在引种栽培过程中，果实发育周期短，并早出现果实脱落现象。果实脱落是发育调控的过程［2-3］，脱落常伴随着与细胞壁相关的基因和酶的活化［4］，果实成熟过程中若遇到干旱、营养过低、气候极端、机械伤害、授精不良等都会促进细胞壁分解导致脱落［5-8］，植物生长调节剂生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素等激素的作用也会加速果实脱落［9］。林木引种适应性包括它在新生境的生长发育情况和繁殖能力［10-11］，本文通过对美国梾木在引种栽培生长周期内果实生理生化变化进行研究，包括果实内含物含量变化、酶活性变化以及内源激素含量变化研究，探索导致美国梾木落果致败的原因，为美国梾木引种栽培研究提供参考依据。

1 试验区概况

试验地位于湖南省林业科学院试验林场内（113°00' E、28°11' N），该区气候属亚热带季风湿润气候，年平均气温 16.8 ℃，年日照时数 1 496～1 850 h，年无霜期 274 天，平均降雨量 1 400～1 900 mm，雨量主要集中在春、夏两季，土壤为黄棕壤［12］。

2 材料与方法

2.1 试验材料

美国梾木（Cornus spp.）于 2010 年通过嫁接方式从美国引种到湖南省林业科学院试验林场，砧木为光皮树实生苗，试验面积约为 0.1 公顷 hm2，2012 年开始结果，通过连续 3 年观察，美国梾木果实具有落果现象而且普遍存在。2016 年5 月，选择生长健壮、结果正常的美国梾木植株作为研究对象，对其果实各项生理生化指标进行测定。

2.2 试验方法

选定目标树种后并于果实开始形成时（5 月中下旬）每隔 10 天采集1次带回实验室，测定相关指标。

2.2.1 果实内含物测定 果实可溶性糖和淀粉含量测定采用蒽酮比色法［13］；还原糖测定采用二硝基水杨酸法（DNS）［14］；蛋白质测定采用考马斯亮蓝法［15］。

2.2.2 过氧化氢酶活性测定 采用紫外分光光度法［16］。取 5.0 g 洗净的果实鲜样，切碎，放入研钵中，加 5 mL 的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，于 3 000 r/min 离心 10 min，上清液转入 25 ml 容量瓶中。沉淀再提取两次，合并上清液于容量瓶中定容。在试管中加 pH 为 7.0 的磷酸缓冲液（0.05 M）2.2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5 ml，浓度为 0.15% 的 H2O20.5 ml，取 0.3 ml 的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470 nm 下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔 30 s 读数一次，记录 5 分钟。以每分钟内A470 变化 0.01 为 1 个酶活性单位（u）。

酶活力（u）=（ΔA×V）/0.01×Δt×μ×W其中：ΔA——吸光度的差值；Δt——反应的时间差（min）；W——样品的鲜重（g）；V——反应液的体积（ml）；μ——加入反应液的体积（ml）。

2.2.3 内源激素测定 采用高效液相色谱（HPLC）法［17］。称取梾木果实 0.7～1 g 用液氮研磨成粉于离心管中，加入 20 mL 的预冷甲醇（80%），加入少量抗氧化剂并摇匀，在 4 ℃ 下避光浸提 10 h。将浸提的样品进行 3 000 r/min 4 ℃离心 20 min，收集上清液。残渣再次用 20 mL 的预冷甲醇（80%）浸提 10 h，3 500 r/min 4 ℃ 离心 15 min，合并上清液。上清液在 38 ℃ 下旋转减压蒸发，除去甲醇。浓缩液用等体积的三氯甲烷萃取两次，加入适量 PVP，3 000 r/min 在 4 ℃ 下离心 5 min，弃下层溶液，合并上层溶液，并且调节 pH 至 2.8～3。再用等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并酯相，然后在 35 ℃ 的烘箱中干燥。残留物用 3 mL 甲醇：0.8% 冰醋酸＝45 : 55 混合液溶解，过 0.45 μm 的微孔滤膜后进行 HPLC 分析。

Agilent 1200 高效液相色谱仪（包括色谱柱、紫外可变波长检测器，四元低压梯度泵，真空脱气机）， 色谱柱为 Eclipse XDB-C18，直径 4.6 mm，尺寸 5.0 mm。色谱条件：流速 0.6 mL/min，紫外检测波长 254 nm，流动相为甲醇：0.8% 的冰醋酸＝45 : 55，进样量：20 uL。

3 结果与分析

3.1 美国梾木果实发育过程中内含物变化

美国梾木果实发育过程中可溶性糖与还原糖的含量变化趋势相同（见图 1 和图 2），7 月初之前可溶性糖与还原糖含量是缓慢增长的，平均递增量分别为 0.05 mg/g 和 1.1 mg/g，至落果前进入快速增长阶段，平均递增量达到 0.45 mg/g 和 6.09 mg/g，增加比较明显；蛋白质含量在果实发育初期递增明显（见图 3），平均递增量为 0. 6 mg/g，6 月初蛋白质含量开始下降，并持续到 6 月底呈抛物线曲折变化后趋于稳定，最终含量保持在 1.14 mg/g；果实淀粉含量在始果期含量最高（见图 4），达到 2.28 mg/g，后急剧下降，6 月初达到最小值 1.53 mg/g 后缓慢增长，最终含量保持在 1.96 mg/g。

图1 果实内可溶性糖含量变化Fig.1 Changes of soluble sugar content in fruits

图2 果实内还原糖含量变化Fig.2 Changes of reducing sugar content in fruits

图3 果实内蛋白质含量变化Fig.3 Changes of protein content in fruits

图4 果实内淀粉含量变化Fig.4 Changes of starch content in fruits

3.2 美国梾木果实发育过程中过氧化氢酶活性变化

过氧化氢酶活性与植物的抗逆性有关，当植物在逆境或衰老过程中，体内活性氧代谢加强促使 H2O2积累，H2O2可以直接或间接氧化细胞内核苷酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞衰老和解体［18-19］。过氧化氢酶可以清除 H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一，活性越高，体内积累 H2O2就越少，细胞的活性就越强，抗性就越强［20］。由图 5 可知，过氧化氢酶活性在果实发育初期活性较强，6 月初活性最强，达到 0.018△OD/min·mg，主要原因是发育初期细胞分裂加速，细胞活性强，抗性强，之后过氧化氢酶活性开始下降，并在 6 月底下降到最小值 0.011△OD/min·mg，这一过程表现出抗性下降的趋势，表现为对环境不适应，呈现衰老迹象，虽然之后至落果前有所提高，是由于果实内对逆境生理调控引起的，但面对环境剧烈变化美国梾木果实逆境生理调控难以达到正常水平，导致落果。

图5 果实内过氧化氢酶活性变化Fig.5 Changes of catalase activity in fruits

3.3 美国梾木果实发育过程中内源激素含量变化

美国梾木果实发育初期，果实内各项生理活动都处于较高水平，所以果实内的细胞分裂素（ZT）、赤霉素（GA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）含量都较高，分别是 208 μg/g，11 μg/g，51 μg/g 和 7 μg/g。在果实发育初期，果实内细胞分裂素（ZT）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）含量变化（见图 6，图 8，图 9）较为缓和，而赤霉素（GA）含量一直到 6 月中上旬产生剧烈变化（见图 7），平均递减幅度 5.89 μg/g，在落果前表现为持续增长状态，平均递增量 3.79 μg/g；5 月底开始，细胞分裂素（ZT）和生长素（IAA）急剧下降并持续到 6 月底，平均递减量分别为 135.89 μg/g和 37.20 μg/g，而脱落酸（ABA）含量急剧降低持续到 6 月中上旬，平均递减量 3.06 μg/g，在落果之前脱落酸（ABA）含量略有增长。

图6 果实内ZT含量变化Fig.6 Changes of ZT content in fruits

图7 果实内GA含量变化Fig.7 Changes of GA content in fruits

图8 果实内IAA含量变化Fig.8 Changes of IAA content in fruits

图9 果实内ABA含量变化Fig.9 Changes of ABA content in fruits

果实落果最直接因素是内源激素脱落酸（ABA）的含量变化，通过脱落酸（ABA）与其他各内源激素含量比值可直观的分析落果原因（见图 10），在整个果实发育过程中，ABA/ZT 保持稳定，说明落果前果肉细胞一直处于持续分裂状态；ABA/GA 变化呈现整体下降趋势，美国梾木通过树体生理调控机制来适应逆境条件，赤霉素（GA）含量持续增加是强化适应逆境的表现；ABA/IAA 呈现缓慢增长趋势，落果前果实一直处于生长状态，但是脱落酸（ABA）含量持续增加打破了两者之间的平衡，导致果实脱落。

图10 果实内脱落酸（ABA）占有比例Fig.1 0 The percentage of ABA in fruit

3.4 美国梾木生理生化指标变化与内源激素含量变化相关性分析

由表 1 可知，美国梾木果实内各项生理生化指标中，酶活性变化与蛋白质变化呈极显著相关，细胞分裂素（ZT）变化与生长素（IAA）变化和脱落酸（ABA）变化显著相关，可溶性糖含量变化与还原糖含量变化呈极显著相关，与生长素（IAA）变化呈负极显著相关，可溶性糖含量增加却促进了还原糖含量增加，生长素（IAA）含量减小，果实生长变慢，能量消耗加快，成为果实落果的诱因。

表1 美国梾木果实生理生化指标相关性分析Tab.1 Correlation analysis of physiological and biochemical indexes of Cornus spp.fruit

4 结论与讨论

一般来讲，植物引种驯化的过程也是一种逆境胁迫，植物在逆境胁迫条件下，内含物发生急剧变化，可溶性糖和蛋白质变化尤为重要，可溶性糖是植物逆境条件下体内参与胁迫调节的有效物质［21］，蛋白质是植物逆境条件下重要的调节物质［22］，果实可溶性糖含量的增加说明美国梾木适应本地区环境的一种表现，蛋白质变化是美国梾木为了提高适应性，加速合成氨基酸，为果实提供生长动力，促进了蛋白质的合成，还原糖含量增加是植物加速衰老的表现［23］，在美国梾木果实脱落前，可能出现呼吸骤变的过程，加速了固形物或干物质的损耗，所以淀粉含量减小，与分析结果相似。结合过氧化氢酶活性变化以及内源激素变化得出以下结论：

（1）果实内通过可溶性糖含量的增长来应对逆境或衰老的变化，但是随着蛋白质的合成变慢，果实内能量提供变慢，可能出现的呼吸骤变现象，导致还原糖含量增加，加剧了果实能量消耗，而固形物淀粉含量没有增加，经过急剧降低后趋于稳定，难以满足果实生长需求，导致落果。

（2）由于发育初期细胞分裂加速，细胞活性强，过氧化氢酶活性最强，果实内部生理调控占据主导地位，随着果实发育过氧化氢酶活性降低并在落果前保持稳定，果实内部生理调控难以达到逆境或衰老影响的水平导致落果。

（3）果实内细胞分裂素（ZT）和生长素（IAA）一直是持续下降的，赤霉素（GA）呈现抛物线变化，落果前呈小幅度的增长，而脱落酸（ABA）含量急剧下降后在落果前基本趋于稳定，通过 ABA/ZT，ABA/GA 和 ABA/IAA 变化分析，果实内部生理调控虽然缓解了逆境或衰老造成的不利影响，但是随着其它植物调节剂的剧烈变化使得脱落酸（ABA）逐渐占据主导地位导致果实脱落。

（4）通过相关性分析，虽然酶活性变化与蛋白质的变化呈极显著相关，细胞分裂素（ZT）与生长素（IAA）和脱落酸（ABA）显著相关，难以分析果实落果现象，但是可溶性糖变化与还原糖变化呈极显著相关，可溶性糖变化与生长素（IAA）变化呈负极显著相关，可溶性糖含量增加却促进了还原糖含量增加，生长素（IAA）含量减小，果实生长变慢，能量消耗加快，成为果实落果的诱因。

［1］Charles L，Satoshi N，Wendell R．Antagonist effects of nonhost fruit volatiles on discrimination of host fruit by Rhagoletis flies infesting apple（Malus pumila），hawthorn（Crataegus spp.），and flowering dogwood（Cornus florida）［J］．Entomologia Experimentalis et Applicata，2005，114（2）：112-115.

［2］张治安．套袋苹果果柄变色果实脱落原因及对策［J］．河北林业科技，2007（3）：59.

［3］管彦良，胡安生，蒋斌芳，等．柑桔果实脱落的机理［J］．科技通报，1996（6）：380-381.

［4］王权帅，赵丹莹，申 琳，等．脱落调节物质对植物器官脱落的调控［J］．西北植物学报，2009（11）：2352-2359.

［5］王男麒，彭良志，邢 飞，等．柑橘落花落果的营养元素含量及其脱落损耗［J］．园艺学报，2013（12）：2489-2496.

［6］王 龙．柿树保花保果及提高坐果率的技术措施[J]．落叶果树，2013（5）：20.

［7］王松标，武红霞，邢姗姗，等．套袋时期对台农1号芒果果实品质的影响［J］．热带作物学报，2010（11）：1890-1894.

［8］吉前华，郭雁君．柑橘产量形成的生理学分析［J］．中国园艺文摘，2011（7）：33-37.

［9］王田利．柿树落蕾落果原因及防止措施［J］．山西果树，2000（2）：44-45.

［10］钟彩虹，曾秋涛，王中炎．果实套袋对猕猴桃采前落果及果实品质的影响［J］．湖南农业科学，2002（4）：34-35.

［11］乌云塔娜，吕祎馨，片山款则．无籽梨品种无籽果实形成原因的初步研究［J］．经济林研究，2016，34（1）：117-122.

［12］陈 梅，李培旺，陈景震，等．喷施植物生长调节剂对蓖麻营养和生殖生长的影响［J］．湖南林业科技，2014，41（5）：1-4.

［13］任俊杰，赵 爽，马华冰，等．‘绿岭’核桃枝条贮藏营养与晚霜冻害发生程度及树体恢复关系的研究［J］．河北农业大学学报，2015（3）：34-40.

［14］王 瑞，谢国庆，陈永忠，等．油茶叶绿素与可溶性蛋白含量年变化及对净光合速率的影响［J］．湖南林业科技，2014，41（3）：9-13.

［15］乔长晟，赵 男，石漫漫，等．基于核糖体工程理论的常压室温等离子体诱变筛选多杀菌素高产菌［J］．中国生物工程杂志，2014（1）：71-78.

［16］杨兰芳，庞 静，彭小兰，等．紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性［J］．现代农业科技，2009（20）：361-363.

［17］于玉梅，刘春香，朱妍妍，等．高效液相色谱法在黄瓜果实内源激素测定上的应用及改进［J］．山东农业科学，2008（7）：97-99.

［18］邱现奎，董元杰，万勇善，等．不同施肥处理对土壤养分含量及土壤酶活性的影响［J］．土壤，2010（2）：249-255.

［19］原红娟，陈 莉，尉淑珍，等．景天植物叶绿素与过氧化氢酶活性的分析［J］．农业与技术，2008（6）：62-63.

［20］陈 刚，王广志，刘秀丽，等．不同处理对烟草种子萌发及过氧化氢酶活性的影响［J］．烟草科技，2002（2）：11-14.

［21］Campos H，Cooper M，Habben J E，etal．Improving drought tolerance in maize: a view from industry［J］．Field Crops Research，2004（90）：19-34.

［22］桑子阳，马履一，陈发菊．干旱胁迫对红花玉兰幼苗生长和生理特性的影响［J］．西北植物学报，2011，31（1）：109-115．

［23］马春花，马锋旺，李明军，等．外源抗坏血酸对离体苹果叶片衰老的影响［J］．园艺学报，2006（6）：1179-1184.

Physiological and biochemical analysis on introduction and cultivation of the Cornus spp.fruit

CHEN Jingzhen1，HE Xiaofang2，TANG Hong2，XIA Li3，LI Peiwang1
（1. Hunan Academy of Forestry，Changsha 410004，China；2. Xinyu Forestry Industry Development Administration，Xinyu 338000，China；3. Hunan Prospecting Designing & Research General Institute for Agriculture，Forestry & Industry，Changsha 410007，China）

In order to find out fruit dropping reason of Cornus spp.from America，we study on the physiological and biochemical indexes of fruit development process by conventional chemical composition analysis in the laboratory，UV spectrophotometry and chromatography techniques.The results showed that：in adversity or senescence，the content of soluble sugar in fruit is continuously increasing, incremental quantity 0.67 mg/g.The content of protein was increased

significantly in the early fruit development，the average increment was 0.6 mg/g，began to decline as parabola at early June then tends to be stable in 1.14mg/g.The content of reducing sugar continued to increase due to respiratory climacteric，increasing amount of 8.63 mg/g.The content of starch reached 2.28 mg/g in the initial development stage then a sharp decline，from the stable in early June to drop before the final content maintained at 1.96 mg/g.The activity of catalase in the fruit continued to increase at the beginning of the fruit development, reached 0.018△OD/min·mg at the beginning of June and dropped to the minimum value of 0.011△OD/min·mg at the end of June.Although there was an improvement before the fall，it was modest.The content of cytokinin（ZT）and auxin（IAA）has been a continuous decline in the fruit，decline were 109.68 μg/g and 38.97 μg/g.The content change of gibberellin（GA）showed parabola change，the average decline was 5.89 μg/g，which had a small increase before dropping， the average increment was 3.79 μg/g.The content of abscisic acid（ABA）decreased sharply until early June，the average decline was 3.06 μg/g，then tended to be stable before dropping.The change of ABA/ZT was stability，ABA/GA showed a decreasing trend，the change of ABA/IAA showed a slow growth trend，abscisic acid（ABA）can lead to dominant fruit.Soluble sugar and reducing sugar were significantly correlated，soluble sugar and growth hormone（IAA）were significantly related to negative changes.The fruit grows slower and consumes too much energy if the content of soluble sugar increased.It is the reason of fruit dropping.

Cornus spp.；fruit drop；inclusion；hydrogen peroxide activity；endogenous hormones

S 793.9

A

1003-5710（2017）05-0006 -06

10.3969 / j.issn. 1003-5710.2017.05.002

2017-03-25

陈景震（1982-），男，山东省泗水县人，副研究员，硕士，研究方向：能源植物及经济林栽培育种

“十二五”国家科技支撑项目“新型油料能源植物选育及栽培示范”（2015BAD15B02）；湖南省林业科学院青年科研创新基金“美国梾木果实发育影响因子及机理研究”（2013LQJ12）

（文字编校：龚玉子）