生物法在石油降解中的应用

周生烁

摘 要：在石油污染日益严重的今天，针对高效降解石油方法的研究处于前言，其中生物法降解石油因其环境污染小、投入成本低以及降解效率高是目前石油降解的首选方法。本人对生物法降解石油做一些介绍，并介绍了目前仍处于实验室研究阶段的基因工程石油降解菌。

关键词：石油降解；生物法；基因工程

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）22-0009-02

石油作為重要化石能源，是工业发展必要的能源物质。但自上个世纪以来，石油运输过程中泄露、石油加工生产工程中产生的废弃物等进入环境，对水体、土壤造成了严重的危害，进而对人类本身的健康造成不良影响。

石油作为重点监控的污染物来源之一，其本身就具有致突变、致癌、致畸的毒性，而且其所含污染物的种类繁多，不同的成分对环境的污染程度不同，且降解和清除的方法不一样。石油作为污染物的主要表现在如下方面：

（1）污染水体。例如海上泄露的原油，其成分种中的芳香烃会在水面形成一层油膜，阻止水体与空气中氧气的交换，导致水中生物的死亡，从而破坏了水中的生态环境。污染地下水会直接对居民的健康造成威胁。

（2）污染土壤。石油中的某些成分嵌入突然会造成土壤的黏连性、渗水性的变差以及阻碍空气的流通性，不利于土壤上植被的存活，以及土壤中微生物的生存，对生态系统造成破坏。

（3）石油中的芳香类物质能对人类和动物的机体产生较大的毒性。进入人体或动物体中的多环芳香烃会造成肾脏和肝脏等的损伤，而且还具有“三致”毒性。高分子烃和低分子烃会形成一层油膜覆盖在植物的表面，隔绝植物与空气中的气体交换以及水分蒸发，而且石油中的低碳化合物能够直接进入植物机体破坏其内部组织结构，从而影响植物的代谢和机能。

1 石油降解原理

1.1 石油降解方法

目前降解时候的方法包括生物法、物理法以及化学法。其中物理以及化学法降解石油能够起到一定的作用，但只能作为处理石油污染的辅助手段来使用，原因有：物理、化学法处理成本耗费太高、很容易造成二次污染。与此同时，生物法处理石油污染，不会存在二次污染的问题，相对于化学法和物理法，生物法对环境友好，效率高而且投入成本低，是目前一种重要且被给予厚望的石油污染处理方法。

石油一般由链状烷烃、环状烷烃、芳香烃、树脂以及沥青质组成。其中短链的链状烷烃可以通过会发作用进入到大气，剩下的成分中，长的链状烷烃以及环状烷烃容易被降解，其次是分子量较低的芳香烃，多环芳烃被降解的难度很大，而树脂和沥青质则是极难被降解。

1.2 生物法降解石油的原理

生物法降解石油的原理是，微生物能利用石油成分中的烃类作为自身的能源物质，通过体内一系列酶促反应介导的氧化、还原以及合成、分解等过程将石油中的碳氢化合物转化成为二氧化碳、水等无机物。不同石油成分被降解的原理不一样，烷烃的降解方式包括双末端氧化、单末端氧化以及亚末端氧化三种。其中双末端氧化和单末端氧化是主要的降解方式，单末端氧化是指在微生物的单末端氧化酶的作用下将烷烃链的一个末端氧化成为醇，并进一步氧化成醛类物质，再进一步氧化成脂肪酸，最后形成的脂肪酸能通过三羧酸循环被当做能源物质利用。双末端氧化主要针对的是带分支的烷烃，在非专一羧基酶的作用下将双链的末端同时氧化成二羧基酸，再在两端进行β-氧化之后，进入到三羧酸循环中。

芳香烃的降解机制有很多种，在细菌和真菌中降解的机制不一样，而在不同的细菌中降解的机制也不一样，相对于烷烃的降解，芳香烃的降解难度更大，在各种不同的降解机制中都需要分子氧的加入以及加氧酶的参与。在细菌中，在加氧酶的催化作用下，分子氧加入到芳香烃中，生成的物质在相关酶的作用下裂解生成邻苯二酚。

2 降解石油的微生物

在自然界中能够降解石油污染的微生物种类繁多，而对于生物法治理石油污染的主要微生物研究对象是细菌。

治理石油污染的细菌一般是在从污染的区域筛选出来的自然界中本来就存在的细菌或者是经过人工改造的工程菌。环境中的诸多因素都会影响细菌降解石油的能力，其中包括温度、湿度、含氧量、酸碱度、盐度以及压力等等。这些因素不仅影响细菌的数量还会对细菌体内的代谢途径造成影响从而影响细菌对石油中各成分中的利用情况。

细菌降解石油的能力源于体内一系列的代谢酶，而有些编码石油降解相关的代谢酶存在在细菌的质粒上。质粒是细菌体内独立于染色体存在的大多数是环状的少数是现状的DNA分子，能自主复制稳定遗传给下一代，是基因工程中常用的载体。有研究表明将带有降解不同石油组分的代谢酶基因的质粒导入到一种细菌株里面，通过选择培养，这些天然质粒在细胞株稳定存在且表达相关的代谢酶，从而选育中良好的石油降解的新菌株。

3 基因工程菌

目前投入石油降解领域使用的细菌大部分是从相关环境中筛选得到的。为了解决单一菌种无法有效降解石油中不同成分的问题，实际中一般使用混合菌种，但这些菌种因为有各自的对营养的需求，在使用过程中菌种之间会发生竞争、抑制，导致了不同菌种的组成比例较之前的配比发生变化。为了解决这些问题，构建高效的基因工程菌很有必要。

目前基因工程菌已经在人工实验条件下表现出良好的石油降解能力。已有研究表明，美国的研究者将带有CAM、NAH、OCT、XAL的4种石油降解质粒导入到宿主细胞内，形成了一种“多质粒超级菌”该细菌能大大地缩短石油在海面上被降解的时间。

目前在实验室构建降解石油的基因工程菌有大致相同的流程：

（1）从油田或者是石油污染的区域分离出多种可降解石油的菌种，再从其中筛选出降解效果最好的菌株。

（2）分析鉴定该菌株的系统发育地位使用的方法包括形态学观察、生理生化测试、抗性的测试以及16SrRNA基因序列同源性分析等。同时对其生长特性、环境影响因素以及对石油的中各组分的降解效果进行研究。例如研究表明该菌株对芳香烃的降解能力较弱。

（3）取已知的芳香烃降解菌株经行其降解能力的测试以及加氧酶活的检测。通过一些的实验手段，包括酶学研究、PCR扩增、质粒的敲除等等确定降解芳香烃的相关酶，针对该酶的基因进行PCR扩增并测序。在大肠杆菌中表达该酶，对其进行进一步的定位以及含量的研究。

（4）将编码相关降解酶的基因重组到自杀质粒上形成重组质粒，自杀质粒带有某段自杀基因能在非指定底物或者是非指定环境中不能生存生长。并将重组质粒通过DNA转移技术导入之前筛选出来的细菌中，形成基因工程菌。

（5）通过对工程菌的生长特性、底物降解的特异性以及酶活性、遗传物质的稳定性等等因素进行研究，直至该工程菌具有降解石油中不同组分且效率较高的效果，同时其生长特性没有发生很明显的改变。

（6）制备工程菌菌剂，在实验室中模拟石油污染的环境修复过程，了解在污染区域的环境条件下，工程菌的降解效率如何。

4 前景与展望

鉴于对环境的破坏很小而且能永久地清除污染物的同时不带来二次污染，使用的经济成本低，生物法治理石油污染是以后该领域的必然趋势。但目前对高分子多环芳烃以及沥青质的降解依然是难以攻克的难题，未来的研究方向可以朝寻找该类石油降解基因方向发展。此外，在实验室研究相对成熟的基因工程菌还未投入到坏境中使用主要是存在如下安全隐患：

（1）工程菌细胞内带有的抗生素基因会导致广泛的耐药菌出现。

（2）工程菌携带的致病因子在环境中传播，后果严重。所以在真正将基因工程菌投入到环境中使用之前，需要慎重的考虑，同时应该应用一些新的方法，例如加入一段自杀基因等使其完成任务后自动消失，解决安全隐患。

参考文献

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