新生SD大鼠心肌细胞的原代培养①

赵 勇，刘晓伟，林治宇，马 雷，徐振宇，吕少春，李梅秀，田国忠

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

新生SD大鼠心肌细胞的原代培养①

赵 勇，刘晓伟，林治宇，马 雷，徐振宇，吕少春，李梅秀，田国忠

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的:探讨乳鼠原代心肌细胞的培养方法，简便稳定地获得高存活率和纯度的心肌细胞。方法: 无菌条件下取1～3d内新生SD大鼠的心室肌组织，首先用胰蛋白酶消化心肌组织一次，再用I型胶原酶短时多次消化，然后应用差速贴壁分离法和化学试剂抑制法纯化心肌细胞。对心肌细胞进行形态学观察、存活率检测和免疫荧光鉴定。结果:台盼蓝染色检测心肌细胞存活率在95%以上。培养24h后的心肌细胞已贴壁生长，呈梭形及多边形，有自发性搏动，48h后细胞伪足相互交织成网，进而形成细胞簇，呈现同步性搏动。免疫荧光鉴定心肌细胞纯度达96%。结论:此种方法能够可靠地获得较高存活率和纯度的原代乳鼠心肌细胞。

心肌细胞；原代培养；新生大鼠

体外培养的原代心肌细胞，其细胞成分单一，且相对集中，具备原有的许多结构和功能，还消除了神经、体液等因素的影响，因此在研究心肌细胞生理、病理、心血管疾病的发病机制及药物作用机理等方面都有广泛的应用。关于心肌细胞原代培养的文献报道很多，但如何获得较高存活率和纯度的心肌细胞仍是关键问题。本研究对乳鼠心肌细胞分离与培养的方法进行了深入探讨，经过一系列实验观察，总结出一种稳定可靠的原代心肌细胞培养方法，能培养出纯度高、活力强的心肌细胞。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1～3d的新生SD大鼠10～16只，雌雄不限，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

胰酶(Beyotime)，I型胶原酶(Sigma)，DMEM(HyClong)，胎牛血清(四季青)，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine，BrdU)(Sigma)，α-横纹肌肌动蛋白(α-Sarcomeric actinin)单克隆抗体(博士德)，FITC(北京中杉金桥)，DAPI(博士德)。

1.3 新生大鼠心肌细胞的制备

取出生1～3d的SD大鼠，雌雄不限，用75%酒精对乳鼠全身皮肤进行消毒3次，在剑突上一肋剪开胸骨，挤出心脏，将心尖周围组织剪下放入预冷的D-Hanks液中反复冲洗3次，将心肌剪成0.5～1mm3大小的糜状物后放入一小玻璃瓶中，加入0.08%胰酶溶液，放入磁力搅拌子，盖好瓶口，放在磁力搅拌器上，37℃水浴下，以60～80r/min转速搅拌消化4min。弃去上清液，再加入0.1%的I型胶原酶溶液反复消化6～9次或者至组织块完全消化(肉眼见组织由红转白呈半透明)为止，每次消化8min，将上清液移入尖头无菌离心管中，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液以终止消化。然后将上清液经200目筛网过滤(去除未消化组织及细胞团)，以1000r/min离心10min，弃去上清液，在沉淀中加入含10%FBS的DMEM培养液，反复轻轻吹打后将细胞悬液移入直径10cm的无菌培养皿中，放入含5%CO2的37℃培养箱中孵育90min，按差速贴壁分离法除去成纤维细胞纯化心肌细胞。取出该培养皿，将未贴壁细胞悬液以2×105/mL密度接种于6孔板中(孔底预先放置无菌6孔板专用细胞爬片)，加入终浓度为0.1mmol/L的BrdU以抑制成纤维细胞生长，放在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。48～60h首次换液且不加BrdU，以后隔1天换液。

1.4 心肌细胞存活率检测

将适量细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液9:1混匀，静置1min，然后将混合液滴于细胞计数板上，计数500个细胞，活细胞不被染色，而死细胞则被染成蓝色。细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%。

1.5 心肌细胞的形态学观察

用倒置显微镜观察细胞的形态变化和搏动情况。

1.6 心肌细胞的免疫荧光鉴定

心肌细胞培养48～60h后取出细胞爬片，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，0.1%Triton X-100透化20min，PBS漂洗3次，10%山羊血清室温封闭30min，加入小鼠抗大鼠α- Sarcomeric actinin(横纹肌肌动蛋白)抗体，4℃过夜，PBS漂洗3次，加入偶联FITC的荧光二抗，避光室温孵育1h，再加入DAPI 避光孵育5 min，倒置荧光显微镜下拍照。随机取10个高倍视野，心肌细胞胞浆被抗α- Sarcomeric actinin抗体特异性染成绿色，DAPI 将细胞核染为蓝色，计数绿色胞质细胞数及蓝色细胞核数。心肌细胞纯度(%)=绿色胞质细胞数/蓝色细胞核数×100%。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 原代培养的心肌细胞存活率检测

光镜下观察计数板上的心肌细胞悬液与台盼蓝溶液的混合液中心肌细胞的颜色，蓝色为死细胞，未染色的为活细胞。经检验，本实验原代培养的乳鼠心肌细胞存活率在(96.68±0.67)%，见表1。

表1 大鼠心肌细胞存活率

2.2 心肌细胞形态学观察

倒置显微镜下观察可见，培养24h后的心肌细胞贴壁生长，伸出伪足呈梭形及多边形，折光度较强，有自发性搏动，但节律和强度不同；48h后细胞伪足相互交织成网，进而形成细胞簇，呈现同步性搏动，频率为40～90次/分钟。

2.3 心肌细胞的免疫荧光鉴定

采用细胞免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察见图1，2，所得心肌细胞纯度达(96.7±3.5)%，见表2。

图1 心肌细胞鉴定IF×(100)

图2 心肌细胞鉴定IF×(600)

实验次数心肌细胞纯度(%)197．2296．8396．9496．5596．3

3 讨论

首先无菌操作非常重要，乳鼠的全身酒精消毒3次，剪开皮肤、取心肌组织的剪刀和剪碎心肌要使用3把不同的剪刀，这三个步骤所涉及的镊子也要区分开，另外在剑突上一肋横行剪开胸骨要避免破坏消化道导致污染。只要进行严格无菌操作，即使不加抗生素细胞培养不会被细菌污染，这样既不会影响细胞的生长，也排除了药物干扰因素。消化心肌组织常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶[1]，胰蛋白酶能水解细胞间的蛋白质，但作用较强，容易损伤细胞膜，单独使用胰蛋白酶，很难稳定得到大量活力较强的心肌细胞。胶原酶作用较温和，通过分解细胞间质中的胶原纤维来释放细胞，在新生大鼠心肌组织中，以I型胶原为主[2]，因此我们选用I型胶原酶来分离心肌细胞，经过多次实验得出使用1% I型胶原酶，短程多次消化，便能获得大量活力较强的心肌细胞。以往常用胰蛋白酶和胶原酶[3～6]的混合液来消化心肌组织，我们也尝试过多次，即使调低酶的浓度，缩短每次消化时间，仍常有消化过度的情况。另外，消化时我们使用磁力搅拌子来搅拌酶液中的心肌组织，使二者充分接触，提高消化效率。消化后的心肌组织中含有大量的成纤维细胞，所以去除成纤维细胞是纯化心肌细胞的关键。根据成纤维细胞贴壁速度快于心肌细胞的特点，本实验采用差速贴壁分离法除去绝大部分成纤维细胞，并结合化学试剂抑制法在培养的48～60h内应用Brdu抑制成纤维细胞的生长，这样能够获得纯度较高的心肌细胞。

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1.国家自然科学基金项目，编号：81370342；2.黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201610222073；3.佳木斯大学科研项目编号：13Z1201531，13Z1201535；4.黑龙江省教育厅科研项目，编号：2016-KYYWF-0608；5.黑龙江省研究生创新项目，编号：YJSCX2012-368HLJ。

赵勇(1977～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副教授。

田国忠(1966～)男，黑龙江北安人，博士，教授，博士研究生导师。E-mail：tgz1966@163.com。

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