白藜芦醇对阿尔茨海默病合并糖尿病大鼠的氧化应激作用

孙治坤 马兴荣 韩 笑 张钱林 张杰文△

1)河南省人民医院神经内科，河南 郑州 450003 2)郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052

·论著科研之窗·

白藜芦醇对阿尔茨海默病合并糖尿病大鼠的氧化应激作用

孙治坤1)马兴荣2)韩 笑1)张钱林1)张杰文1)△

1)河南省人民医院神经内科，河南 郑州 450003 2)郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052

目的观察白藜芦醇对阿尔茨海默病合并糖尿病大鼠模型脑内氧化应激的作用。方法动物随机分为对照组、阿尔茨海默病合并糖尿病模型组、白藜芦醇对照组和白藜芦醇治疗组。模型组采用链脲佐菌素腹腔内注射诱导出糖尿病的大鼠模型，在脑立体定位仪的指导下把凝聚态的Aβ1-40注射到糖尿病大鼠脑内的双侧海马内，白藜芦醇对照组和白藜芦醇治疗组从术后1周开始每天给予25 mg/kg的白藜芦醇灌胃，持续4周。采用Morris水迷宫试验检测大鼠学习记忆水平，同时测定大鼠脑皮质和海马组织乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性以及与氧化应激有关的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)活性的变化情况。结果与对照组相比，阿尔茨海默病合并糖尿病模型组大鼠的学习记忆能力明显下降(P<0.05)，且脑皮质和海马组织内AchE活性明显升高(P<0.05)，而ChAT的活性却明显降低(P<0.05)；阿尔茨海默病合并糖尿病模型组脑皮质和海马组织内MDA的活性与对照组相比明显升高(P<0.05)，而SOD及GSH活性却明显降低(P<0.05)。与阿尔茨海默病合并糖尿病模型组相比，白藜芦醇治疗组上述指标的变化程度均明显减轻(P<0.05)。结论白藜芦醇可明显提高阿尔茨海默病合并糖尿病大鼠的学习记忆能力，其作用机制通过调节脑组织内乙酰胆碱代谢以及氧化应激反应实现。

阿尔茨海默病；白藜芦醇；氧化应激；糖尿病；大鼠；乙酰胆碱酯酶(AchE)；胆碱乙酰转移酶(ChAT)；丙二醛(MDA)；超氧化物歧化酶(SOD)；谷胱甘肽(GSH)

当前，随着人们生活水平的逐渐提高以及整个社会人口老龄化的逐步进展，糖尿病(diabetes melli-tus，DM)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)均已经成为老年人中最为普遍的疾病。临床上，这两种疾病往往并存，给整个社会和家庭带来沉重的负担，然而，目前却没有单纯同时针对这两种疾病的有效治疗措施。白藜芦醇是一种具有强抗氧化功能的化合物，以往研究认为，其在多种、多个系统性疾病中具有保护作用[1-6]。然而，关于其是否可以同时对糖尿病及阿尔茨海默病有保护作用的研究甚少。本研究拟采用AD合并DM大鼠模型，从氧化应激的角度深入探讨白藜芦醇对AD合并DM的作用，为临床治疗同时有DM和AD的患者提供新的理论基础。

1 材料与方法

1．1实验动物分组实验动物是由河南省实验动物中心提供的健康Wistar大鼠，8～10月龄，体质量250～300 g，不限性别。动物购回后常规饲养3 d，观察其有无异常情况，同时用Morris水迷宫试验筛选出60只相对比较灵活的大鼠，按照随机分组的原则，把筛选出来的60只大鼠平均分为4组：对照组(假手术组)、AD合并DM病组、白藜芦醇对照组(假手术后应用白藜芦醇治疗)、白藜芦醇治疗组(AD合并DM模型后应用白藜芦醇治疗)。

1．2 AD合并DM模型腹腔内注射链脲佐菌素(55 mg/kg，STZ，购自美国Sigma 公司，使用前用0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液进行配置，pH 4.5)，3 d后尾静脉采血，测定尾静脉血的血糖含量，当测出的随机血糖持续>16.7 mmol/L的大鼠才符合慢性糖尿病的标准，提示糖尿病大鼠模型成功。当成功造模出糖尿病大鼠后，常规饲养1周，使用10%水合氯醛(3 mL/kg)通过腹腔内注射的方法麻醉糖尿病模型大鼠，通过脑立体定位仪牢固地固定住大鼠的颅骨，然后进行备皮以及皮肤的消毒，切开大鼠的头颅顶中线，切口长约2 cm，小心分离皮下组织，暴露出大鼠的前囟，按照大鼠脑立体定位图谱的指导，在中线旁2.0 mm处轻轻地垂直进针，深度约2.9 mm，然后使用牙科钻把颅骨打开，把1 μL凝聚态的Aβ1-40(购自Sigma 公司，购回后先用生理盐水制成母液存放在-80 ℃的冰箱里，使用前取出在37 ℃的孵育箱中孵育24 h后使用)用5 μL的微量进样器缓缓地注射入糖尿病大鼠的双侧海马内，注入后留针约10 min，缓慢撤针(为避免撤针时凝聚态的 Aβ1-40蛋白溢出来)，撤针后缝合皮肤、消毒伤口[7]。术后常规饲养1周，Morris水迷宫对造模大鼠进行初步筛选，首先检测出对照组大鼠游到平台的平均时间，以平均值+5%作为标准，再检测出造模的大鼠上台所需要的时间，如果所用时间超出这个标准值，表明AD合并DM大鼠造模成功。对照组大鼠的制作是把等体积的柠檬酸缓冲液缓慢注射入大鼠腹腔内及等体积的生理盐水缓慢注射到大鼠双侧海马。白藜芦醇对照组和白藜芦醇治疗组大鼠均在术后1周通过Morris水迷宫初步筛选后，每天给予25 mg/kg的白藜芦醇(购自Sigma公司，使用时溶于2 mL的0.5 g/L羧甲基纤维素钠中)灌胃，连续4周。对照组大鼠及AD合并DM大鼠分别使用等量0.5 g/L羧甲基纤维素钠治疗。

1．3行为学检测参照我们以前的实验方法[7-8]，Morris水迷宫设备购自上海中国医科院，该设备由3个部分组成：圆形的水池、分析系统和自动摄像系统，检测实验有定位航行实验和空间搜索实验。(1)定位航行实验：该实验主要对各组大鼠的行为学进行训练和测试。圆形的水池壁是黑色的，水池的直径约120 cm，深约30 cm，在水中可加入黑色的食用色素，从而使水池中的水不清亮，水温要求恒定在22 ℃左右，把水池均分为4个象限，在第2象限水面下1～2 cm有一个黑色的小圆形平台，直径约9 cm，每只大鼠进行4 d、4次/d的训练，每次训练持续180 s，而每2次训练间隔30 min左右，按照随机原则从4个象限中选择每次训练的入水点，但每相邻两天的入水顺序必须不一致，如果训练时大鼠能够在180 s内上台，就允许这只大鼠在这个小平台上停留约30 s左右；如果大鼠在180 s内的训练时间内不能发现这个平台，就把这只大鼠牵引到这个平台上，并让大鼠停留在平台上约30 s，这种情况下，该大鼠的潜伏期定为180 s。整个训练和检测中，使用摄像头跟踪记录大鼠在水池中的游泳轨迹，记录后把这些数据输入到特定的计算机中计算大鼠到达小平台的潜伏期及游泳距离。(2)空间搜索实验主要是测量大鼠对那个小平台空间位置的记忆保持能力。在前一个实验结束后的次日，撤掉水池中的平台，分2次随机在距离原平台位置最远的2个象限里把实验大鼠放入水中，记录并认真分析该大鼠在平台所在象限内的时间百分比以及游泳距离百分比[7-8]。

1．4大鼠皮质和海马组织内指标的检测参照我们以前的实验方法[7-8]，按照试剂盒的说明书进行检测(AchE及ChAT活性检测试剂盒购自中国南京建成生物公司；MDA及SOD活性检测试剂盒购自中国上海赛默飞科技有限公司；GSH活性检测试剂盒购自美国Cayman Chemical公司)。样品的制作：断头法处死各组大鼠，迅速取出脑组织，冰盒上快速小心剥离出大鼠的大脑皮质和海马组织，分别称重后，冷冻保存在液氮中，使用前取出后加入预冷的生理盐水中，在冰盒上研磨制成组织匀浆，用购自Sigma 公司的Biorad蛋白定量试剂盒进行蛋白含量的检测，测定好样品中蛋白含量后分别仔细按照试剂盒说明书进行指标的测定，具体如下：(1)AchE活性的检测：乙酰胆碱经过AchE的水解可以生成乙酸和胆碱，其中的胆碱与巯基显色剂起反应后可以生成对称三硝基苯(TNB，Sym Trinitrobenzene)，所生成的TNB在412 nm处具有最大的吸光度值，我们通过测定吸光度计算出需要检测的胆碱酯酶活力，所得数值的单位以U/mg Pro表示。(2)ChAT活性的测定：ChAT可以促进胆碱和乙酰辅酶A起反应，其反应的产物和显色剂结合后，在324 nm处具有最佳的吸光度值，通过测定这个吸光度计算出ChAT的活性，结果单位以U/mgPro表示。(3)丙二醛(MDA)的活性测定：硫代巴比妥酸(TBA)可以和MDA结合形成红色产物，该红色的产物在523 nm处有最大吸收峰，通过检测这个吸光光度值可以计算出MDA的活性，其单位用nmol/mg Pro表示。(4)超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：采用黄嘌呤氧化法对SOD的活性进行检测，SOD的活性以每mg组织蛋白中50%的SOD被抑制时所对应的SOD量作为一个亚硝酸盐单位(U/mgPro)表示。(5)谷胱甘肽(GSH)活性检测：由于巯基化合物和二硫代二硝基甲酸起反应时能产生一种化合物呈现出黄色，该化合物在412 nm处具有最大的吸收峰值，我们检测这个吸光度值算出GSH的活性，该活性单位以mg/gPro表示[9]。

2 结果

2．1白藜芦醇对AD合并DM大鼠的空间学习记忆能力的影响定位航行实验结果显示，在大鼠训练的第1～3天，AD合并DM组平均上台前所需要的时间(潜伏期)以及上台前游泳的距离与其他3组相比无明显差别(P>0.05，图1)；第4天时，AD合并DM组平均上台前所需要的时间及上台前所游泳的距离明显高于对照组(P<0.05，图1)，而白藜芦醇治疗组上述指标变化程度均明显低于模型组(P<0.05，图1)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图1 定位航行实验结果 A：各组在训练的4 d中平均上台潜伏期；B：各组在训练的4 d中平均上台前游泳的距离

空间搜索实验结果显示，实验第5天时，撤除掉平台后，AD合并DM组与对照组相比，第2象限中游泳的平均时间百分比和平均距离百分比均明显降低(P<0.05，图2)，但白藜芦醇治疗组在第二象限中无论是游泳的时间百分比还是游泳距离百分比均明显高于模型组(P<0.05，图2)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图2 空间搜索实验结果 A：各组在平台所在象限中游泳的时间百分比；B：各组在平台所在象限中游泳的距离百分比

2．2白藜芦醇对AD合并DM大鼠皮质和海马组织AchE、ChAT活性的影响模型组大鼠脑皮质和海马组织内AchE活性均较对照组明显升高(P<0.05表1)，ChAT的活性均较对照组明显降低(P<0.05，表1)；白藜芦醇治疗组脑皮质和海马组织内AchE活性均较AD合并DM组明显降低(P<0.05，表1)，而ChAT的活性均较AD合并DM组明显升高(P<0.05，表1)。

表1 白藜芦醇对AD合并DM大鼠皮质、海马AchE、ChAT活性的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2．3白藜芦醇对AD合并DM大鼠模型的皮质和海马MDA、SOD活性及GSH含量的影响AD合并DM组脑皮质和海马组织内MDA含量与对照组相比明显升高(P<0.05，表2)，SOD活性与对照组相比明显降低(P<0.05，表2)，GSH含量与对照组相比也明显降低(P<0.05，表2)；白藜芦醇治疗组脑皮质和海马组织内MDA含量与AD合并DM组相比明显降低(P<0.05，表2)，SOD活性与AD合并DM组相比明显升高(P<0.05，表2)，GSH含量与AD合并DM组相比明显升高(P<0.05，表2)。

表2 白藜芦醇对AD合并DM大鼠皮质、海马MDA、SOD及GSH活性影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

近年来，阿尔茨海默病和糖尿病的发病率逐渐增高，尤其是阿尔茨海默病，是一种和年龄相关性疾病，随着人们年龄的逐渐增长，发病率也越来越高。流行病学研究发现，日本人群中65岁以上老年人阿尔茨海默病的患病率3.5%～5.8%；而西方国家阿尔茨海默病的患病率在85岁以上的人群中高达47%～50%。糖尿病的发病率也逐渐增高，国际糖尿病联盟(IDF)最新数据显示，全世界范围内共有4.15亿成年人糖尿病，比2013年增加了0.33亿。研究证实，糖尿病是AD的一个非常重要的高危因素[10-12]，糖尿病患者并发阿尔茨海默病的风险也非常高，这两种疾病往往并存于一个患者中。然而，目前针对糖尿病患者合并阿尔茨海默病的预防以及认知障碍的治疗尚缺乏有效的措施。

白藜芦醇是目前研究及应用较多的一类具有较强抗氧化、清除自由基等作用[4]的化合物，它在多种系统性疾病中均具有保护作用[1-6]。本实验中，我们以氧化应激为指标，首次设想采用AD合并DM的大鼠模型研究白藜芦醇对这两种疾病并存的治疗作用。结果发现，通过水迷宫试验检测表明，白藜芦醇能明显改善AD合并DM组大鼠受损的学习记忆功能(P<0.05)。

中枢胆碱能系统是大脑中与学习记忆关系密切的神经递质，其核心是Ach。Ach是由于胆碱和乙酰辅酶A在ChAT的催化下合成的，由AchE进行分解，因此Ach在脑内含量的动态平衡是由ChAT和AchE共同维持的。阿尔茨海默病的一个标志性的生化特征是脑内ChAT活性下降，当脑内ChAT的活性下降而AchE的活性增高时就加速了Ach的分解，使脑内Ach的含量降低，进而使患者的学习记忆和认知能力下降[13]。本研究发现，白藜芦醇治疗组与AD合并DM模型组相比，大鼠脑皮质和海马AchE的活性明显降低，而ChAT的活性却明显升高(P<0.05)，提示白藜芦醇能改善AD合并DM大鼠脑内Ach的含量。

在对糖尿病或阿尔茨海默病的发病机制研究中，氧化应激都具有重要的地位[14]。在阿尔茨海默病患者中，脑内的氧化应激和自由基可以使乙酰胆碱酯酶的活性受到抑制，提示阿尔茨海默病患者的衰老和痴呆可能与氧化应激相关。在糖尿病的发病中，研究也认为，胰岛素抵抗和β细胞功能受损与氧化应激也是密切相关的。MDA是由氧自由基引起的一种氧化反应的代谢产物，其含量可反映体内生物膜不饱和脂肪酸的过氧化程度，从而间接地反映引起生物膜不饱和脂肪酸发生过氧化反应的氧自由基的水平[15]。SOD是生物体内最为重要的一种氧自由基清除酶，它可以通过催化O2-发生歧化反应清除体内所产成的氧自由基，所以人们可通过测定体内或组织内SOD的活性评估机体清除自由基的能力。GSH在机体内的作用主要是特异性催化还原型谷胱甘肽的还原反应，从而起到稳定细胞膜的结构和保护细胞功能的作用[16]。因此，在该研究中，我们对各组大鼠脑内MDA、SOD及GSH的含量均进行了详细的检测。既往研究发现，白藜芦醇对单独糖尿病大鼠脑内氧化应激有明显的保护作用[17-19]。我们的研究表明，AD合并DM组大鼠脑皮质和海马组织内MDA含量与对照组相比明显升高，而SOD活性及GSH含量却明显降低(P<0.05)，白藜芦醇治疗后，大鼠脑皮质和海马组织上述指标的变化程度均明显降低(P<0.05)，提示白藜芦醇可保护AD合并DM大鼠免遭氧化应激的损伤。

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EffectsofresveratrolonthememoryimpairmentandoxidativestressinratmodelofAlzheimer'sdiseasewithdiabetesmellitus

SUNZhikun*，MAXingrong，HANXiao，ZHANGQianlin，ZHANGJiewen

*DepartmentofNeurology，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003，China

ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on memory impairment and oxidative stress in the rat model of Alzheimer's disease with diabetes mellitus．MethodsWe used the streptozotocin intraperitoneal injection and then Aβ1-40hippocampal injection to establish the Alzheimer's disease with diabetic rat model．The spatial learning and memory performance were tested by the Morris water maze，we also examined the activity of acetylcholinesterase (AchE)，choline acetyltransferase (ChAT)，malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in cortex and hippocampus．ResultsThe results showed that resveratrol could successfully inhibit the memory impairment，increase the ChAT，SOD and GSH activity，decrease the AchE and MDA activity in diabetic with Alzheimer's disease rat model．ConclusionResveratrol can protect the Alzheimer's disease with Diabetic rat model by decreasing memory impairment and oxidative stress．

Alzheimer’s disease；Resveratrol；Oxidative stress；Diabetes mellitus；Rats；Acetylcholinesterase(AchE)；Choline acetyltransferase(ChAT)；Malondialdehyde(MDA)；Superoxide dismutase(SOD)；Glutathione(GSH)

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.23.001

河南省医学普通科技攻关资助项目(201503154)

△通信作者：张杰文(1965-)，男，博士，主任医师。研究方向：痴呆与认知障碍。Email：zhangjiewen9900@126．com

R-332

A

1673-5110(2017)23-0001-05

(收稿2017-02-10)

夏保军

信息：孙治坤，马兴荣，韩笑，等．白藜芦醇对阿尔茨海默病合并糖尿病大鼠的氧化应激作用[J]．中国实用神经疾病杂志，2017，20(23)：1-5．