“肾主骨”机理研究——左归丸对Hepcidin、Fpn1及OPG/RANKL mRNA表达的影响❋

吴佳莹，李岳泽，刘 红，李 艳，潘静华，赵宏艳，王少君，汪文来，张治国，鞠大宏△，刘梅洁△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2. 中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

【实验研究】

“肾主骨”机理研究
——左归丸对Hepcidin、Fpn1及OPG/RANKL mRNA表达的影响❋

吴佳莹1，李岳泽1，刘 红2，李 艳2，潘静华2，赵宏艳2，王少君2，汪文来1，张治国1，鞠大宏2△，刘梅洁2△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2. 中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

目的： 从Hepcidin对其下游OPG/RANKL通路调节的角度，初步探讨左归丸对骨质疏松症的作用机理，并为进一步揭示“肾主骨”理论的科学内涵提供实验依据。 方法： 60只雌性SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组12只，假手术组12只，造模组36只共3组，造模组大鼠实行双侧卵巢切除术以制作骨质疏松症模型。造模结束后再将造模组大鼠随机分为OVX组、E2组、左归丸组，每组各12只，开始给予相应药物。给药3个月后，检测大鼠胫骨骨量(TBV%)、骨吸收(TRS%)和骨形成(TFS%、OSW、MAR、mAR)情况；采用原位杂交法检测各组大鼠肝组织中Hepcidin mRNA及胫骨骨髓中Fpn1、OPG及RANKL mRNA的表达。 结果： OVX组大鼠胫骨TBV%较假手术组显著降低，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR较假手术组均有显著增高；与OVX组比较，左归丸组的TBV%显著增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR水平明显低于OVX组。与假手术组比较，OVX组大鼠肝脏中Hepcidin的mRNA表达强度均明显降低，大鼠胫骨骨髓中Fpn1和RANKL mRNA表达强度则明显增强，OPG mRNA的表达强度明显降低。与OVX组比较，左归丸组的大鼠肝组织中Hepcidin mRNA表达强度明显增高，胫骨骨髓中OPG mRNA表达强度明显增高，Fpn1和RANKL mRNA表达强度则明显下调。结论： 左归丸可通过提高Hepcidin水平，增加与受体Fpn1的结合，进而对下游OPG/RANKL信号通路起到一定的调节作用，使OPG表达上调而下调RANKL的表达，从而降低破骨细胞活性，减少骨量丢失，这是其能够治疗骨质疏松症的机理之一。

左归丸；骨质疏松症；铁调素；膜转铁蛋白；肾主骨

铁调素(Hepcidin)是纠正体内“铁过载”的关键物质。多项研究已证实，铁过载是骨质疏松症发生的危险因素。而Hepcidin与受体膜转铁蛋白(Fpn)结合，可调节铁离子水平，维持机体铁稳态，进而对骨代谢产生影响。OPG/RANKL则是非常重要的骨代谢调控通路，是体内细胞因子发挥作用、调节骨代谢的最终环节。我们前期工作证实，左归丸可以治疗去卵巢大鼠骨质疏松症。本研究在前期工作基础上[1]，从Hepcidin对其下游OPG/RANKL通路调节的角度，初步探讨左归丸对骨质疏松症的作用机理，为进一步揭示“肾主骨”理论的科学内涵提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

60只雌性SPF级SD大鼠，体质量(240±20) g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(许可证编号SCXK-(军)2012-0004)，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室(实验动物室许可证号SYXK(京)2010-0032)。

1.2 药物

戊酸雌二醇片1 mg/片(批号175A)，拜耳医药保健有限公司广州分公司产品，使用时用纯净水配制成混悬液，浓度为0.018 mg/ml。左归丸药液常规水煎制，含药量为0.968 g生药/ml。药物组成：熟地24 g，山药12 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，鹿角胶12 g，菟丝子12 g，龟甲胶12 g，川牛膝9 g。中药材均经中国中医科学院中药研究所胡世林研究员鉴定。

1.3 试剂

戊巴比妥钠：德国MERCK公司(批号20131206)，盐酸四环素：北京索莱宝科技有限公司(批号1104B047)，Hepcidin原位杂交检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司(批号02161TW7032741507TEC)，Fpn1原位杂交试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司(批号02162TW7032741807TEC)，OPG原位杂交试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司(批号011590223-259060FJ)，RANKL原位杂交试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司(批号006381129-79060FJ)。

1.4 仪器

2040切片机：德国Reicheit-Jung公司， FINESSE ME+全自动石蜡切片机：美国Thermo公司，CRYOTOME FSE冰冻切片机：美国Thermo公司，Qwin Pro V3.5.0图像分析系统：德国Leica公司，DM6000B显微镜：德国Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 动物模型制作及分组给药 60只SPF级雌性SD大鼠，按随机数字表法分为造模组36只，空白对照组12只，假手术组12只3组。对造模组大鼠施以双侧卵巢切除(OVX)手术，制作骨质疏松症模型。假手术组大鼠仅切除卵巢周围脂肪组织，不摘除卵巢。造模完成后，将造模组大鼠随机分成OVX组、E2组、左归丸组。左归丸组大鼠灌胃给予左归丸水煎液，E2组大鼠灌胃给予戊酸雌二醇混悬液，空白对照组、假手术组和OVX组大鼠灌服等体积的纯净水，每日1次，每周给药6 d，休息1 d，连续给药3个月。

图1 各组大鼠胫骨骨小梁分布情况 (甲苯胺蓝染色)

各组大鼠于对骨组织进行荧光标记[2]：处死前16 d和前3 d分别腹腔注射盐酸四环素30 mg/kg体质量。给药结束后，取左侧胫骨制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学指标的检测；制作肝组织石蜡切片，检测肝脏Hepcidin mRNA；取右侧胫骨脱钙，制作冰冻切片，检测大鼠胫骨骨髓中Fpn1、OPG、RANKL 的mRNA表达。

1.5.2 指标检测 (1)骨组织形态计量学指标检测[3-6]：取大鼠左侧胫骨进行塑料包埋，使用2040切片机纵向切取5 μm不脱钙骨切片制作2张，一张用甲苯胺蓝染色，另一张直接进行荧光观察。采用Leica Qwin V3图像分析系统，对不脱钙骨切片进行骨组织形态计量分析：①骨量检测：测量骨小梁面积占被测骨髓腔总面积的百分比，即骨小梁面积百分比(TBV%)，这是衡量骨量水平的主要标志；②骨吸收情况检测：测量不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，即骨小梁吸收表面百分比(TRS%)，据此判断破骨细胞的活性；③骨形成情况检测：骨小梁形成表面百分比(TFS%)：有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比；④类骨质平均宽度(OSW)：皮质内表面有成骨细胞被覆的类骨质平均宽度，反映皮质骨的成骨细胞活性；⑤骨小梁矿化率(MAR)：指骨小梁表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数，可反映骨小梁矿化速度；⑥骨皮质矿化率(mAR)：皮质内表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数，可反映皮质骨矿化速度。

(2)Hepcidin、Fpn1、OPG及RANKL mRNA表达的检测：采用原位杂交法分别检测各组大鼠肝组织中Hepcidin mRNA及胫骨骨髓中Fpn1、OPG及RANKL mRNA的表达。结果判断，阳性反应细胞呈棕黄色，用Leica-Qwin图像分析系统进行检测。随机检测5个高倍视野(×400)，计算每个视野内的积分光密度(IOD)，求其平均值作为mRNA表达强度。

2 结果

2.1 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响

2.1.1 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨TBV%的影响 图1表1显示，OVX组大鼠胫骨TBV%显著低于假手术组。E2组、左归丸组大鼠胫骨TBV%较OVX组显著增高，但仍显著低于假手术组。

2.1.2 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨TRS %和TFS %的影响 表2显示，与假手术组比较，OVX组大鼠胫骨TRS %和TFS %均显著增高。E2组和左归丸组的大鼠胫骨TRS %和TFS %均显著低于OVX组，且E2组大鼠胫骨TFS %与假手术组比较差异无统计学意义；但左归丸组大鼠的胫骨TRS %和TFS %以及E2组大鼠的TRS %仍明显高于假手术组。

表1 各组大鼠胫骨TBV%的变化

注：与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与OVX组比较：△P<0.05，△△P<0.01(下同)

表2 各组大鼠胫骨TRS %和TFS %的变化

2.1.3 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨OSW、MAR和mAR的影响 表3显示，OVX组大鼠的胫骨OSW、MAR、mAR均显著高于假手术组。与OVX组比较，E2组和左归丸组的大鼠胫骨OSW、MAR、mAR均显著降低；E2组的上述指标与假手术组比较差异无统计学意义，但左归丸组的OSW、MAR、mAR仍显著高于假手术组。

表3 各组大鼠胫骨OSW、MAR、mAR的变化

2.2 Hepcidin、Fpn1、OPG及RANKL mRNA表达的检测

2.2.1 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠肝组织中Hepcidin mRNA表达的影响 表4显示，与假手术组比较，OVX组大鼠肝组织中Hepcidin mRNA表达IOD显著降低；与OVX组比较，E2组和左归丸组的肝组织中Hepcidin mRNA表达IOD则明显升高，但仍显著低于假手术组。

表4 各组大鼠肝组织中Hepcidin mRNA的变化

2.2.2 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中Fpn1 mRNA表达的影响 表5显示，与假手术组比较，OVX组大鼠的胫骨骨髓中Fpn1 mRNA表达IOD显著增高；与OVX组比较，E2、左归丸组的Fpn1 mRNA表达IOD显著降低，但仍明显高于假手术组。

表5 各组大鼠胫骨骨髓中Fpn1 mRNA表达的变化

2.2.3 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL mRNA表达的影响 表6显示，与假手术组比较，OVX组大鼠的胫骨骨髓中OPG mRNA表达IOD显著降低；与OVX组比较，E2组、左归丸组的OPG mRNA表达阳性密度明显增高，且E2组OPG mRNA表达IOD与假手术组比较差异无统计学意义；左归丸组OPG mRNA表达IOD仍明显低于假手术组。

与假手术组比较，OVX组大鼠胫骨骨髓中RANKL mRNA表达IOD显著增高；与OVX组比较，E2组、左归丸组RANKL mRNA表达的IOD均显著下降，但仍高于假手术组。

表6 各组大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL mRNA表达的变化

3 讨论

肾藏精，精生髓，髓为骨之养，髓充则骨坚有力，髓虚则骨脆易折。《素问·六节藏象论》云：“肾者……其充在骨。”由此可知，骨骼中的骨量多少与“肾”的虚实状态紧密相关。左归丸是补精益肾的代表方剂。本研究结果显示，OVX组大鼠胫骨TBV%显著低于假手术组，而反映骨吸收情况的指标TRS%、反映骨形成情况的指标TFS%、OSW、MAR、mAR较假手术组均有显著增高，说明卵巢切除可以导致大鼠骨量显著降低，同时骨吸收与骨形成均明显升高，即形成高转换型骨质疏松症动物模型；与OVX组比较，左归丸组的TBV%显著增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR水平明显低于OVX组，表明经左归丸治疗后可提高OVX大鼠的骨量，并降低过高的骨转化率。这与我们以往的研究结果相一致[7-12]。

近年研究发现，铁调素是维持铁稳态、纠正 “铁过载”的关键物质，而铁过载是骨质疏松症发生的危险因素[13-15]。Hepcidin由肝细胞合成后，通过血液调控铁的分布与小肠对铁的吸收。铁调素水平下降，不能诱导其受体-膜转铁蛋白(Fpn)内陷降解，因此铁离子不断从细胞内输出，释放入血的铁不断增加，最终造成铁过载；由于体内铁水平的升高，成骨细胞分化受到抑制，功能降低，骨形成减少；同时破骨细胞活性增强、骨吸收增加、骨量减少，可导致骨质疏松症。本研究检测各组大鼠肝脏组织中Hepcidin mRNA的表达，以及大鼠胫骨骨髓中Hepcidin受体Fpn1 mRNA的表达，研究结果显示，与假手术组比较OVX组大鼠肝脏中Hepcidin的mRNA表达强度均明显降低，大鼠胫骨骨髓中Fpn1 mRNA表达强度则明显增强。与OVX组比较，左归丸组的大鼠肝脏Hepcidin mRNA表达强度明显增高，骨髓中Fpn1表达强度则明显下调，说明大鼠切除卵巢后，Hepcidin水平降低，其与受体Fpn1的结合受到抑制，而左归丸可在一定程度上逆转这一过程。

OPG/RANKL是非常重要的骨代谢调控通路，在破骨细胞生成、发育、激活等一系列过程中起至关重要的作用，是体内细胞因子发挥作用、调节骨代谢的最终环节。RANKL主要参与破骨细胞的分化和激活，OPG是RANKL的天然阻滞受体，可抑制破骨细胞活化，保护骨组织。以往的研究表明[16-18]，左归丸对骨质疏松症大鼠体内OPG、RANKL有调节作用。现有研究证实，铁调素对OPG具有调节作用[19-20]。本研究结果显示，OVX组大鼠胫骨OB和MSC中OPG mRNA的表达强度较假手术组明显降低，RANKL mRNA的表达强度则明显升高；与OVX组比较，左归丸组的OPG mRNA表达强度明显增高，RANKL mRNA的表达强度则明显降低。这一结果说明，左归丸对OPG/RANKL信号通路具有一定的调节作用，即上调OPG表达，同时下调RANKL的表达，最终使破骨细胞活性降低，骨吸收减少，以达到治疗骨质疏松症的作用。这可能是左归丸的直接作用，也可能是通过调节Hepcidin水平而实现的。

综上所述，大鼠去卵巢3个月后可成功复制经典的肾虚型骨质疏松症模型。在肾虚状态下，Hepcidin水平降低，骨髓细胞上的Fpn1内陷降解因而被抑制，使铁离子过多转运至细胞外，导致铁过载，从而刺激破骨细胞的活性；其下游的OPG/RANKL信号通路亦被影响，其RANKL表达增加而OPG表达减少，促进破骨细胞的生成、分化和激活，最终导致破骨细胞异常活跃，骨量丢失加剧。而左归丸一方面可通过提高Hepcidin水平，改善卵巢切除所致的铁过载，进而对下游的OPG/RANKL信号通路起到一定的调节作用；另一方面，亦可直接作用于OPG/RANKL信号通路，上调OPG表达而下调RANKL的表达，最终使破骨细胞活性降低，减少骨量丢失，这是其能够治疗骨质疏松症的机理之一。

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R285.5

B

1006-3250(2017)11-1548-04

国家自然科学基金资助项目(81473551)

吴佳莹(1992-)，山西运城人，医学硕士，从事中医药防治骨质疏松症的基础研究。

△通讯作者：鞠大宏(1963-)，辽宁凤城人，研究员，博士研究生导师，从事中医痹症的临床与基础研究，Tel:13641386362,E-mail:judahong@126.com。

2017-04-11