TPX2基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制研究

汪 博，巨荣侠，付建华

陕西省宝鸡市陈仓医院消化内科，陕西 宝鸡 721300

TPX2基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制研究

汪 博，巨荣侠，付建华

陕西省宝鸡市陈仓医院消化内科，陕西 宝鸡 721300

目的探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制。方法RT-PCR及Western blotting检测胃癌组织及癌旁组织中TPX2 mRNA和蛋白表达；将NC-siRNA、TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3转染人胃癌SGC-7901细胞，未转染任何siRNA作为对照组，Western blotting检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达；CCK8实验检测人胃癌SGC-7901细胞转染12、24、48 h后细胞增殖情况；细胞转染48 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blotting检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果胃癌组织中TPX2 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P<0.01)；NC-siRNA组TPX2蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3组的TPX2蛋白表达均显著低于对照组(P<0.01)，TPX2-siRNA3组的抑制效果更明显，选择作为后续研究；NC-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TPX2-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率均显著低于对照组，且随着时间延长细胞存活率降低(P<0.01)；NC-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TPX2-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于对照组，PI3K、p-AKT蛋白表达显著低于对照组(P<0.01)。结论TPX2在胃癌中高表达，沉默TPX2的表达能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖和促进细胞凋亡，其机制可能与PT3K/AKT信号通路的调控有关。

TPX2基因；胃癌；增殖；凋亡

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤首位，死亡居第2位。在任何年龄段都有胃癌的发生，但总体发病率随着年龄的增长上升[1-2]。目前主要采用手术切除，放化疗辅助，但一部分处于进展期的胃癌患者不能进行手术，只能通过化疗，但化疗药物本身具有毒副作用，大大降低患者的生存质量[3]。因此，寻找引起胃癌的发病机制及治疗方法具有重要意义。

肿瘤的发生是一个多分子水平、多基因、多阶段的复杂过程，而抑癌基因的失活或癌基因的激活是引起肿瘤发生的关键原因[4]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)，分子量为100 kD，是新近发现的受细胞周期调控的一种核增殖相关蛋白[5]。研究[6-7]显示，在肺癌、膀胱癌、结肠癌等多种肿瘤中有TPX2的高表达，且TPX2的高表达影响了肿瘤的侵袭及进展。也有研究[8]指出，TPX2是一个候选的癌基因，可作为肿瘤预后不良相关的分子标记。但目前关于TPX2对胃癌的影响及机制研究尚不明确。因此，本研究首先检测了TPX2在胃癌中的表达，并通过RNA干扰技术沉默TPX2，研究其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及机制，以期为胃癌的分子治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1组织和细胞收集陕西省宝鸡市陈仓医院消化外科2012年3月至2016年2月手术病理切除并保存的胃癌及癌旁组织冻存标本50例，男30例，女20例，平均年龄62.6岁。术前均未行放疗及化疗。所有标本的采集均经过患者及家属的知情同意。人胃癌细胞株SGC-7901由西安交通大学细胞生物研究中心提供。

1.2主要试剂和仪器胰酶、胎牛血清(fetal calf serum,FBS)、RPMI 1640培养基、青链霉素均购自美国Gibco公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒、CCK8试剂盒、Annexin V-FITC凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；siRNA-NC、TPX2-siRNA购自上海生工生物工程有限公司；TPX2、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved caspase-3)、PI3K、AKT、p-AKT单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国Abcam公司；CO2细胞培养箱购自美国西盟公司；酶标仪、PAGE凝胶电泳仪、电泳凝胶图像分析系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.3实时定量PCR利用Trizol法提取胃癌及癌旁组织中的总RNA，紫外分光光度计检测提取RNA质量。OD值在1.8～2.0被认为是合格的样品。根据NCBI数据库中公布的人mRNA序列，用Oligo 6.0软件设计目的基因TPX2及内参基因GAPDH的RT-PCR引物。TPX2引物序列：上游引物：5′-ACCTTGCCCTACTAAGATT-3′，下游引物：5′-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3′。GAPDH引物序列：上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增条件：A：预变性 95 ℃ 10 min；B：变性95 ℃ 10 s；退火56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 20 s，共40个循环。C：72 ℃ 15 min。每个样品做6个重复，取均值采用2-△△Ct法对数据进行相对定量分析。

1.4胃癌中TPX2基因的蛋白表达胃癌组织及相应的癌旁组织放入预先预冷的研钵中研磨成粉末，加入适量的裂解液置于冰上裂解反应30 min，收集细胞，4 ℃，13 000 r/min离心15 min，收集上清。BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液充分混匀，100 ℃孵育器中煮沸5 min变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳后转印蛋白至PVDF膜上，转膜后质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉封闭膜2 h，以1∶1 000稀释的TPX2基单克隆抗体作用一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。TBST清洗后加入ECL发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析蛋白表达水平。

1.5细胞培养将保存于液氮罐中的人胃癌SGC-7901细胞用含有质量浓度为100 g/L FBS及双抗的RPMI 1640细胞培养基置于37 ℃，体积分数为5%的CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养。观察到细胞融合度达到80%时，弃去培养液。用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞，用完全培养基终止消化，根据实验要求进行传代。

1.6细胞转染及转染效果检测取生长至对数期的人胃癌SGC-7901细胞，以1×105ml-1浓度每孔加入2 ml接种至6孔细胞培养板中，细胞密度达到50%时，参考Invitrogen 公司的LipofectamineTM2000转染方法和条件将对照组(空脂质体转染组)、siRNA-NC(转染100 nmol/L的Negative siRNA)、TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2和TPX2-siRNA3(转染100 nmol/L的TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2和TPX2-siRNA3)转染到细胞内，室温静置30 min后，每组细胞中取500 μl加入到人胃癌SGC-7901细胞中，置于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养4 h，更换细胞培养液继续培养。取转染48 h后的细胞，利用Trizol提取细胞中的蛋白，BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度。按照1.4方法检测各组细胞中TPX2蛋白表达。

1.7细胞增殖检测以5×104ml-1浓度每孔加200 μl将上述转染后生长至对数期的细胞接种至96孔细胞培养板中，37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养12、24、48 h后，向每孔细胞中加入CCK-8试剂10 μl，37 ℃条件下孵育4 h，酶标仪在490 nm波长处测定并记录各组的吸光度A。计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=(转染组细胞A/对照组细胞A)×100%。

1.8细胞凋亡检测将生长至对数期的人胃癌SGC-7901细胞以1×106ml-1接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养24 h后，加入NC-siRNA、TPX2-siRNA至细胞中继续培养48 h，未转染任何siRNA的细胞作为对照组，取1 ml细胞悬液至离心管中，4 ℃，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，细胞中加入200 μl结合缓冲液及PI和 Annexin-V各5 μl，室温避光静置20 min后，再加入400 μl结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9Westernblotting检测Cleavedcaspase3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达各组转染后的人胃癌SGC-7901细胞培养48 h，提取细胞中的蛋白，BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度，按照1.4方法检测Cleaved caspase3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。

2 结果

2.1TPX2基因在胃癌组织及癌旁组织中的表达RT-PCR及Western blotting检测胃癌组织及癌旁组织中TPX2的表达，结果显示，TPX2在胃癌组织及癌旁组织mRNA表达分别为3.977±1.221、1.017±0.326，蛋白表达分别为0.234±0.026、0.056±0.007,TPX2在胃癌组织的mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P<0.01)(见图1)。

注：与癌旁组织比较，**P<0.01。图1 TPX2基因在胃癌组织及癌旁组织的表达 A：TPX2的mRNA表达；B：Western blotting检测TPX2的蛋白表达Fig 1 Expression of TPX2 gene in gastric cancer tissues and adjacent tissues A: expression of TPX2 mRNA; B: expression of TPX2 protein by Western blotting

2.2TPX2在转染后细胞中的表达Western blotting检测NC-siRNA、TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3组转染人胃癌SGC-7901细胞后TPX2的蛋白表达，结果显示，NC-siRNA组TPX2蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3组的TPX2蛋白表达均显著低于对照组(P<0.01)，TPX2-siRNA3组的抑制效果更明显，选择作为后续研究(见图2、表1)。

图2 TPX2在转染后的人胃癌SGC-7901细胞中的表达Fig 2 Expression of TPX2 in transfected human gastric cancer SGC-7901 cells

组别TPX2的蛋白表达对照组0.273±0.031NC-siRNA0.277±0.029TPX2-siRNA10.201±0.025**TPX2-siRNA20.141±0.021**TPX2-siRNA30.057±0.017**

注：与对照组比较，**P<0.01。

2.3抑制TPX2的表达降低人胃癌SGC-7901细胞增殖CCK8实验检测NC-siRNA组和TPX2-siRNA组细胞转染48 h后的细胞增殖情况，结果显示，NC-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，TPX2-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率均显著低于对照组，且随着时间延长，细胞存活率降低(P<0.01)(见图3)。

注：与对照组比较，**P<0.01。图3 抑制TPX2的表达降低人胃癌SGC-7901细胞增殖Fig 3 Inhibiting of TPX2 expression reduced the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells

2.4抑制TPX2的表达促进人胃癌SGC-7901细胞凋亡NC-siRNA组和TPX2-siRNA组细胞转染48 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况及凋亡相关蛋白Cleaved caspase3蛋白表达，结果显示，NC-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，TPX2-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于对照组(P<0.01)(见图4、表2)。

图4 抑制TPX2的表达对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响 A：流式细胞仪检测结果；B：Western blotting检测结果

组别细胞凋亡率/%蛋白表达量对照组1.68±0.670.053±0.009NC-siRNA1.71±0.720.055±0.011TPX2-siRNA115.83±1.22**0.123±0.019**

注：与对照组比较，**P<0.01。

2.5抑制TPX2的表达下调PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达Western blotting检测NC-siRNA组和TPX2-siRNA组细胞转染48 h后PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达，结果显示，NC-siRNA组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TPX2-siRNA组PI3K、p-AKT蛋白表达均显著高于对照组(P<0.01)(见图5、表3)。

图5 抑制TPX2表达对PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达影响Fig 5 Effect of inhibiting of TPX2 expression on the expressions of PI3K, AKT and p-AKT proteins

3 讨论

胃癌是最常见的恶性程度较高的肿瘤之一，具有早期症状不明显、复发率高、淋巴结转移早等特点，且近些年胃癌的发病率有年轻化的趋势， 这给人们的生命健康造成了严重的威胁。胃癌的发生与抑癌基因的失活、癌基因的激活、细胞周期异常调控等有关[9-10]。

表3 Western blotting检测抑制TPX2的表达后PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达Tab 3 The expressions of PI3K, AKT and p-AKT detected after the expression of TPX2 inhibited by Western blotting(±s)

注：与对照组比较，**P<0.01。

明确引起胃癌的分子机制对于胃癌的治疗具有重要意义。TPX2位于人染色体20q11.2，是一种微管相关蛋白，在纺锤体聚集及着丝点微管形成中有重要作用。在多种肿瘤中有TPX2高表达，其表达影响肿瘤的发生、发展[11]。研究[12]显示，在结肠癌中TPX2呈现高表达，其过表达与血管侵袭、临床阶段及转移密切相关。食管鳞癌中也发现TPX2的高表达，其表达可作为食管鳞癌的独立预后判定因子[13]。宫颈癌中TPX2的高表达与淋巴结转移、组织学分级、FIGO阶段密切相关[14]。这说明TPX2可能作为一个癌基因影响肿瘤的发生、发展。本研究检测TPX2在胃癌中的表达，结果也发现TPX2在胃癌中的高表达。

RNA干扰是一种基因阻断技术，能使特定基因表达沉默，从而抑制基因的表达，是研究基因功能有效的方法[15]。研究显示，沉默TPX2的表达可抑制肝癌细胞的侵袭，从而抑制肿瘤进程。通过RNAi抑制TPX2的表达可诱导宫颈癌细胞凋亡及增加S期和G2期细胞的比率[16]。此外，TPX2-siRNA能有效地抑制胰腺癌、前列腺癌细胞的增殖及促进细胞凋亡[17]。本研究已检测到TPX2在胃癌中高表达，通过RNAi技术沉默TPX2的表达，研究其对胃癌细胞增殖凋亡的影响，结果显示，沉默TPX2的表达后能显著抑制胃癌细胞的增殖及促进细胞凋亡。细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激下的一种程序性死亡过程，可通过内源性和外源性途径启动细胞凋亡，但无论是经过哪一种途径引起细胞凋亡，最终都会引起Caspase的活化，活化的Caspase引起其靶向蛋白水解，最终引起胃癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的凋亡。Caspase3是Caspase家族的关键蛋白，处在Caspase级联反应下游，被称为“凋亡的执行者”[18-19]。本研究进一步检测Cleaved caspase3蛋白表达，结果显示，抑制TPX2的表达可显著下调Cleaved caspase3蛋白表达。3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是磷脂酰肌醇及肌醇的主要激酶，其家族成员属于原癌基因。AKT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，PI3K激活的AKT可通过磷酸化作用抑制或激活下游的P21、Caspase9、mTOR等靶蛋白，从而介导多种细胞因子、胰岛素等促进细胞增殖，并发挥抗凋亡作用[20]。研究显示，PI3K/AKT信号通路影响了多种肿瘤的发生、发展，用PI3K/AKT信号通路抑制剂后可显著降低乳腺癌、肺癌、胶质瘤等多种肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡[21-23]。本研究检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达，结果显示，抑制TPX2的表达可显著下调PI3K、p-AKT蛋白表达。

综上所述，TPX2在胃癌中高表达，沉默TPX2的表达可通过调控PT3K/AKT信号通路抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖和促进细胞凋亡，该研究为胃癌临床上分子治疗提供了理论基础。

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ExpressionofTPX2geneingastriccanceranditsmechanismofproliferationandapoptosisingastriccancercells

WANG Bo, JU Rongxia, FU Jianhua

Department of Gastroenterology, Chencang Hospital, Baoji City of Shaanxi Province, Baoji 721300, China

ObjectiveTo investigate the expression of TPX2 gene in gastric cancer and its effect on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells.MethodsThe expressions of TPX2 mRNA and protein in gastric cancer tissues and adjacent tissues were detected by RT-PCR and Western blotting; NC-siRNA, TPX2-siRNA1, TPX2-siRNA2 and TPX2-siRNA3 were transfected into human gastric cancer SGC-7901 cells, and not transfected with any siRNA as the control group; the expression of TPX2 protein in transfected cells was detected by Western blotting; cell proliferation transfected for 12, 24, 48 hours was detected by CCK8 assay; after cell transfection 48 h, cell apoptosis was detected by flow cytometry; the expressions of PI3K, AKT, p-AKT protein were detected by Western blotting.ResultsThe expressions of TPX2 mRNA and protein in gastric cancer tissue were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.01); the expression of TPX2 protein in NC-siRNA group and control group had no significant difference (P>0.05), the expression of TPX2 protein in TPX2-siRNA1, TPX2-siRNA2, TPX2-siRNA3 groups was significantly lower than that in the control group (P<0.01), the inhibitory effect in TPX2-siRNA3 group was more obvious, was choiced as a follow-up study; the cell survival rate at 12, 24, 48 h in NC-siRNA group had no significant difference compared with control group (P>0.05), the cell survival rate at 12, 24, 48 h in TPX2-siRNA group was significantly lower than that in the control group, and the survival rate of cells was decreased with the time prolonging (P<0.01); the apoptosis rate of cells and expressions of Cleaved caspase3, PI3K, AKT, p-AKT protein in NC-siRNA group had no significant difference compared with control group (P>0.05), the apoptosis rate of cells and the expression of Cleaved caspase3 protein in TPX2-siRNA group were significantly higher than those in control group, the expressions of PI3K and p-AKT protein were significantly lower than those in the control group (P<0.01).ConclusionTPX2 is highly expressed in gastric cancer, the expression of TPX2 can inhibit the proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901, and its mechanism is related to the regulation of PT3K/AKT signaling pathway.

TPX2 gene; Gastric cancer; Proliferation; Apoptosis

汪博，主治医师，研究方向：消化道疾病。E-mail: 529041976@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.12.009

R735.2

A

1006-5709(2017)12-1355-05

2017-01-16

李健)