乳腺癌患者新辅助化疗前后Topo Ⅱ蛋白变化及其对术后化疗方案的指导意义

李文祥 魏 瑾 胡森焱 荀 江 马 平 洪灵芝 龚建平

乳腺癌患者新辅助化疗前后Topo Ⅱ蛋白变化及其对术后化疗方案的指导意义

李文祥 魏 瑾 胡森焱 荀 江 马 平 洪灵芝 龚建平

目的研究乳腺癌新辅助化疗前后Topo Ⅱα阳性表达及其对术后化疗方案选择的指导作用。方法对TNM分期Ⅱb及以上的乳腺癌患者行新辅助化疗治疗后，适合手术的患者行保乳手术治疗。免疫组化法测定新辅助化疗前后的Topo Ⅱα阳性表达，对比化疗前后、不同化疗方案化疗后的阳性表达情况，记录对比Topo Ⅱα阳性表达和阴性表达患者的术后疗效。结果CMF方案化疗前后的Topo Ⅱα阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)；EC方案化疗后Topo Ⅱα阳性表达率显著高于化疗前(P<0.05)，且显著高于CMF方案组(χ2=4.219，P=0.040<0.05)；ECT方案化疗后Topo Ⅱα阳性表达率显著高于化疗前(P<0.05)，且显著高于CMF方案组(χ2=6.522，P=0.011<0.05)。EC方案组和ECT方案组化疗后，Topo Ⅱα阳性表达无统计学差异(χ2=0.269，P=0.604>0.05)。化疗前Topo Ⅱα阳性表达的患者，CR+PR率、中位TTF显著高于阴性表达的患者(P<0.05)，腋窝淋巴结转移低于阴性表达的患者(P<0.05)。结论含蒽环类药物的化疗方案具有促进Topo Ⅱα阳性表达，提高术后疗效的作用，在术后辅助化疗方案中可以添加蒽环类药物，增加化疗敏感性。

新辅助化疗；Topo Ⅱα；术后化疗

在影响女性生命健康的恶性肿瘤中，乳腺癌发病率最高，占所有女性恶性肿瘤的7%～10%，且近年来呈现逐年上升的趋势，并呈现年轻化趋势。乳腺癌作为一种全身性疾病，在早期即可发生全身扩散，对其治疗应采用全身治疗和局部治疗相结合的综合治疗方法。新辅助化疗作为乳腺癌综合治疗的重要组成部分，逐渐被重视，由于肿瘤细胞多药耐药的存在，往往导致化疗失败，因此，研究肿瘤细胞对化疗药物的耐药性和敏感性是新辅助化疗的目的之一。Topo Ⅱ是大多数蒽环类药物的作用靶点，对预测肿瘤细胞耐药性和敏感性具有重要意义。本文测定接受新辅助化疗前后乳腺癌患者Topo Ⅱ蛋白变化，并研究其对术后化疗方案的选择的指导意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2013年5月至2016年5月，选取我院和南京医科大学附属南京医院与江苏省肿瘤医院就诊的乳腺癌女性患者103例，所有患者均经病理检查确诊，年龄23～74岁，年龄中位数为45.2岁。淋巴结转移阳性患者68例，淋巴结转移阴性患者35例；肿瘤>5 cm患者27例，>2～5 cm患者65例，≤2 cm的患者11例；TNM分期Ⅱb期及以上52例。所有患者均未接受过任何放疗、化疗或手术治疗，无合并其他肿瘤。

1.2 方法

1.2.1 试剂一抗 鼠抗人Topo Ⅱα单克隆抗体、SP染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；其他试剂购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2 Topo Ⅱα蛋白的免疫组化法测定 所有组织标本修剪后，用10%福尔马林溶液固定，清洗、脱水、透明后，石蜡包埋，保持4 μm厚连续切片，烘片。石蜡切片脱蜡、脱水、清洗，高温修复冷却至室温后，清洗，并加入一抗，4 ℃孵育24 h后，取出，清洗，加入二抗，于37 ℃下孵育30 min，DAB显色、冲洗后，苏木精复染，冲洗、脱水，干燥后封片。于10×40高倍显微镜下观察。阴性对照组用正常PBS代替一抗，其他步骤均相同。操作过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.3 结果判读 Topo Ⅱα蛋白表达阳性判读：所有乳腺癌标本染色后，由3位以上病理医师通过双盲法进行读片，最后讨论统一。Topo Ⅱα染色位于细胞核，表现为清晰棕黄色或棕褐色。于高倍显微镜下观察切片，每个切片随机选取5个视野进行结果判定。阳性细胞(核染色强度为+++)比例>10%为阳性；或阳性细胞(核染色强度为++)比例≥50%为阳性。

1.2.4 化疗方法 患者化疗前血常规、肝肾功能及心电图检查均正常。采用随机数表法，将TNM分期Ⅱb及以上患者分为3组，分别给予新辅助化疗：CMF方案组(环磷酰胺600 mg/m2、甲氨蝶呤40 mg/m2、5-氟尿嘧啶600 mg/m2)、EC方案组(表柔比星60 mg/m2、环磷酰胺600 mg/m2)、ECT方案组(表柔比星60 mg/m2、环磷酰胺600 mg/m2、紫杉醇200/m2)。3组一般临床资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有临床可比性。见表1。化疗2个周期后，对于适合保乳手术治疗的患者行保乳手术治疗。分别于新辅助化疗前后，粗针穿刺取得患者肿瘤组织标本，测定Topo Ⅱα，统计阳性表达数。

1.2.5 疗效评价 疗效评价按照世界卫生组织统一标准进行评价，完全缓解(CR)+部分缓解(PR)为有效；疗效持续时间(TTP)：从本次治疗开始到肿瘤进展的时间，TTF：治疗开始到病变进展时间，包含任何原因中断治疗日期为止。

1.3 数据处理

所有临床和实验数据采用SPSS 19.0进行数据处理。计数资料以例表示，前后比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新辅助化疗前后Topo Ⅱα阳性表达对比

3组化疗前，Topo Ⅱα阳性表达例数无统计学差异(P>0.05)。CMF方案组化疗前后对比，Topo Ⅱα阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)。EC方案组，Topo Ⅱα阳性表达，化疗前后差异有统计学意义(P<0.05)；化疗后阳性表达例数显著增加，与CMF组相比，差异有统计学意义(χ2=4.219，P=0.040<0.05)。ECT方案组，Topo Ⅱα阳性表达化疗前后差异有统计学意义(P<0.05)；化疗后阳性表达例数显著增加，与CMF方案组相比，差异有统计学意义(χ2=6.522，P=0.011<0.05)。EC方案组和ECT方案组，化疗后，Topo Ⅱα阳性表达无统计学差异(χ2=0.269，P=0.604>0.05)。见表2。

2.2 化疗前Topo Ⅱα阳性表达与临床疗效、预后及远处转移的关系

化疗前Topo Ⅱα阳性表达的患者，CR+PR率、中位TTF显著高于阴性表达的患者(P<0.05)，腋窝淋巴结转移低于阴性表达的患者(P<0.05)。见表3。

3 讨论

表1 3组一般临床资料对比/例

表2 3组新辅助化疗前后Topo Ⅱα阳性表达对比/例

表3 化疗前Topo Ⅱα阳性表达与临床疗效、预后及远处转移的关系

注：*为与Topo Ⅱα阴性比较，P<0.05。

新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NACT)又称术前化疗、诱导化疗和首次化疗，是指对肺转移性肿瘤在局部手术或放疗前，应用全身性、系统性的细胞毒药物进行治疗[1-2]。

随着循征医学的发展，个体化化疗逐渐应用于乳腺癌的治疗。新辅助化疗作为个体化化疗的第一步，一方面可以降低局部晚期乳腺癌分期，缩小原发肿瘤，提高早期乳腺癌患者保乳手术的成功率[3]；另一方面控制和杀灭全身微转移癌、亚临床扩散病灶[4]；其次，作为体内化疗敏感试验，了解癌细胞对化疗药物的敏感度和耐药性，为术后化疗方案的选择提供指导[5-7]。雌激素受体(estrogen receptor,ER)/孕激素受体(progesterone receptor,PR)[8]、Bcl-2凋亡基因[9]、HER-2基因[10-11]、Ki-67[12-14]是目前研究较多的新辅助化疗疗效预测因子。

DNA作为遗传物质，在细胞生长及新陈代谢过程中起到至关重要作用。肿瘤的发生发展过程涉及到DNA的结构变化和修复。近年来，拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,Topo Ⅱα)用于新辅助化疗疗效评估逐渐受到重视。TopoⅡα是原发性肿瘤细胞增殖的标志物，与肿瘤级别的增高成正相关关系。Topo Ⅱα是一种基本的细胞核酶，其编码基因位于染色体17q21-22，具有改变DNA拓扑学结构的作用，其表达具有细胞周期依赖性的特点，通常在S期表达最多，在DNA的合成、转录、核分裂及染色体结构形成、分离和浓缩过程具有重要作用[15-16]。位于二聚体酶2个亚基上的酪氨酸，在其残基间的酯基转移作用下，Topo Ⅱα剪切并打开DNA双链，使DNA双螺旋松弛，双螺旋缺口增大，缺口在第二股DNA双螺旋通过后关闭，Topo Ⅱ与DNA链之间的共价连接被撤销，DNA双螺旋结构被拧紧而恢复结构，在细胞分裂间期核基质、有丝分裂期染色体配对、染色体分离、基因重组和转录及修复等过程紧密联系[17]。研究显示，Topo Ⅱα是许多细胞毒药物的作用靶点，主要有蒽环类、鬼臼碱类、蒽醌类等[18]。其耐药机制表现为以下三个方面：①Topo活性降低；②磷酸化水平增加；③基因点突变或缺失，导致细胞毒药物不能与该酶结合，抑制DNA断裂，引起耐药。Topo Ⅱα表达下调或性质改变，形成DNA酶易解离复合物，降低化疗药物的敏感性，活性或含量的降低，最终导致肿瘤细胞耐药的产生。肖海风等[19]研究发现，蒽环类化疗药物对Topo Ⅱα阳性表达者的效率是阴性表达者的3.077倍，Topo Ⅱα表达降低严重影响蒽环类药物化疗的敏感性。帅萍[20]在乳腺癌组织中Topo Ⅱα的研究中发现，Topo Ⅱα基因的扩增可以有效改善蒽环类化疗药物辅助治疗效果。本文研究了不同新辅助化疗方案治疗前后的乳腺癌患者Topo Ⅱα变化，结果显示：3种化疗方案化疗前，Topo Ⅱα阳性表达率无统计学差异(P>0.05)，化疗后EC方案组及ECT方案组Topo Ⅱα阳性表达率显著高于CMF方案组，而EC方案组和ECT方案组化疗后Topo Ⅱα阳性表达无统计学差异。在对Topo Ⅱα阳性表达和阴性表达患者的疗效研究中，发现阳性表达的患者的有效率、中位TTF和腋窝淋巴结转移显著高于阴性表达的患者(P<0.05)，说明Topo Ⅱα阳性表达的患者对化疗药物，尤其是蒽环类药物的敏感性较高，提示我们在术后辅助化疗中，对阳性表达的患者应用含蒽环类药物的化疗方案可以有效改善患者的疗效。

综上所述，含蒽环类化疗方案的新辅助方案化疗后，患者Topo Ⅱα阳性表达显著增加，有利于提高患者术后的疗效。对于新辅助化疗后患者Topo Ⅱα阳性表达显著增加的患者，为了提高术后辅助化疗药物的敏感性，提高疗效，可以选用含蒽环类药物。

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ChangesofTopo-ⅡProteininPatientswithBreastCancerbeforeandafterNeoadjuvantChemotherapyandItsGuidingSignificanceforPostoperativeChemotherapy

LIWenxiang,WEIJin,HUSenyan,etal.

GaochunPeople’sHospital，Nanjing,211302

ObjectiveTo study the expression of Topo Ⅱα in breast cancer patients before and after neoadjuvant chemotherapy and its guiding significance in the selection of postoperative chemotherapy.MethodsBreast cancer patients with stage Ⅱb and above were treated with neoadjuvant chemotherapy.Patients who suit for surgery were treated with breast conserving surgery.The expression of Topo Ⅱα before and after neoadjuvant chemotherapy were detected by immunohistochemistry.Compared the positive expression of Topo Ⅱα before and after neoadjuvant chemotherapy and the effect between patients with positive and negative expression of Topo Ⅱα.ResultsThe expression of Topo Ⅱα in CMF regimen before and after chemotherapy was not statistically significant (P>0.05).The number of positive expression patients accepted EC chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy (P<0.05) and was significantly higher than that of CMF (χ2=4.219,P=0.040<0.05).The number of positive expression patients accepted ECT chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy (χ2=6.522,P=0.011<0.05).There was no significant difference between EC and ECT group in the positive expression of Topo Ⅱα(χ2=0.269,P=0.604>0.05).The CR+PR rate,median TTF were significantly higher in patients with Topo Ⅱα positive expression than those with negative expression (P<0.05)，axillary lymph node metastasis was lower(P<0.05).ConclusionChemotherapy regimen containing anthracycline can increase the expression of Topo Ⅱα and improve the curative effect.The anthracyclines can be added to the postoperative adjuvant chemotherapy regimen to increase the chemosensitivity.

Neoadjuvant chemotherapy;Topo Ⅱα;Postoperative chemotherapy

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1918～1921)

江苏省南京市卫生局科技项目(编号:YKK12175)

211302 江苏省南京市高淳人民医院(李文祥，魏 瑾，胡森焱，荀 江，马 平)；210029 南京医科大学附属南京医院(洪灵芝)；210009 江苏省肿瘤医院(龚建平)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.12.002

R737.9

A

1001-5930(2017)12-1918-04

2017-02-24

2017-10-25)

(编辑：甘艳)