不同磁珠对过敏原蛋白纯化效果的比较研究

李文娇1,2,3,阎 俊1,2,杜 娟1,2,3,黄天娇 1,2,3,卢 瑛1,2,3,4,5,6,7*

1.上海海洋大学食品学院,上海 201306

2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306

3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,上海 201306

4.农业部冷库及制冷设备质量监督检验测试中心,上海 201306

5.国家淡水水产品加工技术研发分中心,上海 201306

6.上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台,上海 201306

7.食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学),上海 201306

虾蟹等甲壳类和鱼类水产品，因其味道鲜美、营养丰富，是百姓餐桌上常见的食物。但是，水产品过敏可引起严重的健康问题，如过敏性皮炎、荨麻疹、哮喘、过敏性鼻炎、口腔综合症、肠病综合症等，严重的会导致过敏性休克并危及生命[1]。甲壳类水产品的主要过敏原为原肌球蛋白（Tropomyosin，简称Tm），分子量35-38 kDa，对酸、热、蛋白酶均有较强的耐受性，稳定性较高[2]。通常，研究水产品的过敏原活性需要对其进行分离纯化。传统的纯化蛋白方法有硫酸铵分级沉淀[3]、凝胶柱层析[4]、离子交换层析[5]、高效液相[6]等，它们均存在费时、操作复杂的缺点。

作为一种新型纳米材料，磁珠能用于检测毒素[7]、病毒[8]、细菌[9]等，也可用于分离特定生物分子[10]。磁性分离技术是以磁性微粒为载体，在外加磁场的定向控制下，利用磁性微粒表面的配体和受体间的特异性亲和作用，可从复杂的原始生物体系中直接分离出目标生物分子，具有简单方便和高选择性的双重优势，为生物分子的快速分离和富集提供一种强有力的手段[11]。

本文以南美白对虾的过敏原Tm及其特意性单克隆抗体为模式体系，选用2种不同的商业磁珠构建免疫磁珠，利用亲和纯化法快速分离与纯化虾主要过敏原Tm，通过评价其纯度和得率，比较了两种磁珠对过敏原的纯化效果。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

鲜活南美白对虾购于上海临港水产品市场；HRP-兔抗鼠IgG抗体（美国Invitrogen生命技术公司）；MES（2-吗啉乙磺酸）、EDC［1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺］、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，美国Pierce公司）；A磁珠（PM3-008，上海奥润微纳新材料科技有限公司）；B磁珠（Bangs磁珠，东莞市汉诺生物技术有限公司）；0.22 μm PVDF膜（美国Millipore公司），甘氨酸、2-吗啉乙磺酸（MES）、硼酸（BS）、15%SDS-PAGE预制胶、透析袋、非预染Marker（26610）和预染蛋白Marker（26616）、BCA蛋白定量检测试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；二氨基联苯胺（DAB，美国Sigma公司）；其他试剂如无特殊说明均为分析纯。2A7H6单抗为本实验室早期研究制备的抗体细胞株纯化所得。

HPPS5001高性能纳米粒度分析仪（英国Malvern公司）；JEM-1230透射电子显微镜（美国Lake Shore公司）；垂直混合器（HS-3，宁波新芝生物科技股份有限公司）；磁力架（上海奥润微纳新材料科技有限公司）；漩涡振荡器（QL-901，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；超声波清洗器（SK5200HP，上海科导超声仪器有限公司产品）；mini-蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad公司）；半干式转膜仪（AE-8135，日本ATTO公司）；凝胶扫描仪（UMAX，力广科技股份有限公司）；冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 免疫磁珠的制备

参考Liu等[12]的NHS/EDC化学偶联方法，将Tm的单克隆抗体2A7H6与磁珠化学偶联。首先，分别取A和B两种磁珠1 mg，用50 mM MEST溶液（含0.05%Tween-20，pH 5.2）洗涤3次，分别加入1.6 μg的EDC和NHS，混合均匀后室温反应30 min。然后用MEST洗涤磁珠3次，再用10 mM硼酸盐缓冲液（简称BST，含0.05%Tween-20，pH 9.0）洗涤2次，分别加入25、50、75、100和125 μg的2A7H6抗体，室温混合反应3 h。反应结束后收集上清液用于偶联量测定。用BST洗涤3次后，加入500 μL封闭液（含1%BSA的BST溶液），室温反应30 min。最后，将免疫磁珠重悬在500 μL保存液（含0.05%NaN3和0.1%BSA的BST溶液）中，4℃冷藏备用。

1.3 原肌球蛋白富集液的制备

虾类Tm的富集纯化参照孙佳益等[13]的方法，并略作修改。首先将虾肉制成丙酮粉，过夜抽提后进行硫酸铵浓缩，透析后得到Tm的富集样本，-30℃保存备用。

1.4 免疫磁珠分离纯化原肌球蛋白

首先，取制备好的免疫磁珠，用500 μL 20 mM PBS溶液（pH 7.2）洗涤3次后，加入1 mg Tm富集液反应30 min，然后回收上清液用于蛋白定量。接着用500 μL PBS洗涤磁珠2次，加入500 μL 20 mM甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.7）于垂直混合器上反应，洗脱15 min。在收集洗脱液的离心管中提前加入适量的Tris-HCl缓冲液（pH 9.0），使洗脱液pH保持中性。洗脱后的免疫磁珠用MEST缓冲液洗涤4次后重悬在500 μL保存液中，4℃冷藏保存。

1.5 偶联量的测定

以免疫磁珠制备以及免疫磁珠纯化过敏原过程中回收的上清液作为样本，采用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白含量。并根据下面公式计算得到偶联量和偶联率：

抗体偶联量（μg）=加入的抗体的量-上清中的抗体量

抗体的偶联率（%）=（加入的抗体量-上清中的抗体量）/加入的抗体量

1.6 SDS-PAGE和Western blot

采用SDS-PAGE和Western-blot分别鉴定Tm的纯度和特异性。用15%的预制胶进行电泳，考马斯亮蓝（CBB）染色后，用凝胶扫描仪拍照成像。另取电泳后的凝胶，用半干式电转印法[14]将蛋白转印到PVDF膜上，加入封闭液（含1%BSA的PBS，pH 7.2）反应1 h。用PBST洗涤3次后分别和单抗2A7H6、HRP-兔抗鼠二抗（1:5000稀释）室温反应1 h，最后用DAB底物溶液显色并拍照。

1.7 磁珠粒径测试和形貌表征

利用马尔文动态光散射粒度仪（DLS）测试磁珠偶联抗体前后的水力学粒径；采用JEM-1230透射电子显微镜对免疫磁珠表面形貌进行表征。

2 结果与讨论

2.1 抗体偶联效率

为比较两种磁珠的抗体偶联效率，我们设置了5个添加量的抗体分别与两种磁珠（A、B）进行偶联。通过BCA定量，分别得到A、B免疫磁珠的偶联量和偶联率结果，如图1所示。由图1（a）可见，两种免疫磁珠的抗体偶联量均与抗体添加量呈正比关系，且在任一抗体添加量下，A磁珠的抗体偶联量均高于B磁珠。并且从图1（b）中对比两种磁珠偶联率的结果可知，A磁珠的偶联效率也明显高于B磁珠。同时，我们发现当2A7H6抗体添加量大于75 μg时，A、B磁珠的抗体偶联率均随着抗体添加量的增加而明显降低。抗体添加量在75 μg时偶联率最高，但是偶联的抗体总量低于100、125 μg，而偶联的抗体越多越有利于后续的纯化实验，因此我们结合实际偶联量并考虑经济因素，最终确定两种磁珠最优的抗体添加量为100 μg。

图1 A、B磁珠的抗体偶联量(a)和偶联效率(b)比较Fig.1 Comparison of amount of coupling antibody(a)and coupling efficiency(b)of magnetic beadsAand B

2.2 过敏原的洗脱效果评价

图2为免疫磁珠纯化过敏原Tm的SDS-PAGE（左图）和Western blot（右图）结果。在CBB染色后的电泳图中，条带3、4分别是A和B免疫磁珠的洗脱液，分子量约为36 kDa，与报道相符合[15]。Western blot所用抗体2A7H6对甲壳类和部分软体动物的主要过敏原Tm均有特异性反应[16]，在Western blot（右图）中可以清晰看到，36 kDa蛋白质和2A7H6抗体有特异性反应条带，表明洗脱液中含有Tm过敏原。此外，Western blot图中条带3略深于条带4，说明免疫磁珠B纯化的抗原量少于免疫磁珠A。其纯化效果见表2，免疫磁珠A可结合较多Tm，为免疫磁珠B的1.5倍；且免疫磁珠A的洗脱率也明显高于B，约1.8倍。对于1 mg富集液样本，免疫磁珠A纯化Tm的得率是47.9%，为免疫磁珠B的3倍。由此得出，不同的免疫磁珠对目标蛋白的纯化效果有显著差异。

图2 原肌球蛋白过敏原的洗脱结果（左图，SDS-PAGE；右图，Western blot）1.粗蛋白提取液 Crude protein extract；2.过敏原富集液 Enrichment solution of allergen；3.免疫磁珠A分离的Tm Purified Tm by immunomagnetic beads A；4.免疫磁珠B分离的Tm Purified Tm by immunomagnetic beads BFig.2 Elution result of Tm(left,SDS-PAGE;right,Western blot)

表1 两种免疫磁珠对过敏原的纯化效果比较Table 1 Purification effects of Tm for immunomagnetic beads A and B

2.3 影响机制讨论

为了解析两种磁珠对Tm过敏原纯化效果的差异性产生原因，我们对磁珠的粒径和形貌进行了分析。磁珠A在偶联抗体前后的平均水力学粒径分别为184.9 nm和294.7 nm，多分散系数（PDI）由0.036变为0.051，呈现出较好的分散性。磁珠B偶联抗体前后的平均水力学粒径分别为375.6 nm和1002 nm，PDI由0.170变为0.451，分散性能变差，出现较明显的团聚现象。图3是两种免疫磁珠的电镜图。图中可以看出，免疫磁珠A呈单分散均匀分布，而免疫磁珠B则呈现较多粒子团聚，分散性能差。一些研究已发现，磁珠的形状、粒径等对免疫层析实验影响较大，单分散性能差的免疫磁珠会发生堵塞现象[17-19]。因此，我们推测以A、B两种磁珠制备的免疫磁珠纯化过敏原Tm，其纯化效果的显著差异主要是由于这两种磁珠的分散性能引起的，B磁珠偶联抗体时出现团聚降低了抗体偶联效率，从而影响其纯化效果。

图3 免疫磁珠的电镜照片，比例尺为200 nm（左图，免疫磁珠A；右图，免疫磁珠B）Fig.3 TEM images of immunomagnetic beadsA(left)and B(right).The scale is 200 nm.

3 结论

磁分离技术具有反应时间短、操作简便、所得抗原纯度高等优点，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。本研究比较了两种商业磁珠制备成的免疫磁珠对目标抗原的纯化性能，结果表明磁珠A的抗体偶联量高于磁珠B，且免疫磁珠A对抗原的纯化产量约为B的3倍。此外，我们发现磁珠的粒径、单分散性对于磁性纳米材料应用于纯化活性物质有重要的影响。整个纯化过程在1 h内，极大地缩短了过敏原纯化的时间，为以后过敏原的纯化提供了一定的理论基础与实验依据。

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