氯化铯密度梯度离心法提纯枣疯病植原体DNA

刘玲雪+肖琦+杨淑珂+路兴波+高瑞

摘要：本研究利用CTAB法提取感染枣疯病的枣树叶片总DNA，再通过氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心从总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。利用枣树26S rDNA基因和枣疯病植原体16S rDNA基因的特异引物，分别对富集纯化前后感病枣树叶片总DNA进行PCR扩增。结果表明，模板浓度为1 ng/μL时，富集后的总DNA模板扩增枣树26S rDNA的电泳条带亮度低于富集前，扩增枣疯病植原体16S rDNA电泳条带亮度明显高于富集前。Real-time PCR检测结果表明，模板浓度为1 ng/μL时，纯化后的枣疯病植原体DNA中26S rDNA相对纯化前的量为0.0638，而JWB相对纯化前的量为0.5035，这说明采用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法可以有效地从感染枣疯病枣树总DNA中富集純化枣疯病植原体DNA。

关键词：枣疯病；植原体；CTAB法；氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心

中图分类号：S763.1：S665.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）11-0134-04

Separation and Purification of Phytoplasma Genomic DNA

of Jujube Witches Broom by Cesium Chloride Density

Gradient Centrifugation

Liu Lingxue， Xiao Qi， Yang Shuke， Lu Xingbo， Gao Rui

（Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Provincial Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， China）

AbstractThe total DNA was extracted from infected jujube leaves using CTAB method and then the genomic DNA of jujube witches broom（JWB） phytoplasma was separated and purified from the total DNA by cesium chloride-bisbezimide density gradient centrifugation method. The specific primers aimed to 26S rDNA of jujube and 16S rDNA of JWB phytoplasma were designed to conducted PCR amplification with infected jujube total DNA before and after purification as template respectively. Our findings suggested that when the concentration of template DNA was 1 ng/μL， the electrophoretic band brightness of 26S rDNA of purified phytoplasma DNA was lower than that of total DNA， but the electrophoretic band brightness of JWB was brighter. Moreover， the results of real-time PCR showed that when the concentration of template DNA was 1 ng/μL， the amount of 26S rDNA in the purified phytoplasma DNA relative to that in total DNA was 0.0638， while the amount of JWB relative to that in total DNA was 0.5035. It suggested that the phytoplasma DNA could be effectively isolated and purified from infected jujube total DNA by the method of cesium chloride-bisbezimide density gradient centrifugation.

KeywordsJujube witches broom； Phytoplasma； CTAB method； Cesium chloride-bisbezimide density gradient centrifugation

植原体（phytoplasma）是一类无细胞壁、不能人工培养、存在于植物筛管细胞内的病原细菌。世界各地已报道的植原体可引起1 000余种植物的系统性病害，涵盖农作物、园艺、花卉、果树和林木等。我国也已报道了100多种植物上发生与植原体相关的病害[1]。枣疯病（jujube witchesbroom disease）是我国枣树最严重的病害，也是世界典型的植原体病害之一，其病原为枣疯植原体（jujube witchesbroom phytoplasma），属于榆树黄化16SrV-B亚组[2]。枣树感病后结果量减少，品质下降，通常2～3年内病树丧失产量并全株死亡。枣疯病几乎分布于国内主要枣树栽培区，每年造成死树高达千万株，直接经济损失达数亿元，已严重阻碍我国枣树产业的可持续发展[3]。由于植原体不能分离培养，难以得到高纯度的植原体基因组DNA，因此，目前仅有少数植原体分离物完成了全基因组测序，并且各个种之间基因组结构变化较大，这为在分子水平上阐明枣疯病植原体及其他植原体的致病机制及进行病害防治等带来了难以克服的困难[4]。

氯化铯密度梯度离心是分离和纯化DNA常用的方法之一，纯化的DNA可用于文库构建、基因组测序及核酸杂交等研究。氯化铯在一定的离心时间和离心力下会形成线性的密度梯度，而不同GC含量的DNA会聚集在不同位置，由此可以将DNA中的不同组分在空间上进行分离。双苯酰亚胺可以与DNA中富含AT的序列结合，在紫外灯下可以观察到蓝色的荧光，便于DNA条带的观察和收集[5]。植原体DNA中AT含量高达72.6%～78.6%，而GC含量仅为21.4%～27.4%，因此可以利用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法通过多轮离心分离目的条带，达到分离纯化DNA的目的。本研究拟通过氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法从感病枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA，并利用荧光定量PCR分析分离效果，以期为进一步实施枣疯病植原体的基因组测序奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

取枣树的健康植株和带有枣疯病症状的植株样本，分成小份用锡箔纸包裹后放在液氮中快速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。

1.2枣树及植原体总DNA的提取

总DNA的提取方法参考Porebsk的CTAB法[6]。称取0.2 g枣树叶片，在液氮中充分研磨成粉末后装入离心管中，加入1 mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2% CTAB，1% PVP，1% β-巯基乙醇），混匀，65℃保温2 h（期间不时轻缓颠倒混匀），加入1 mL氯仿∶异戊醇（24∶1），轻缓颠倒混匀溶液，13 000 r/min离心20 min至分相，将上清转移到干净的离心管中，再次加入1 mL氯仿∶异戊醇（24∶1），轻缓颠倒混匀溶液，13 000 r/min离心20 min，將上清转移到干净的离心管中，加入1 mL异丙醇，放入-20℃冰箱冷冻30 min，13 000 r/min离心20 min，弃上清，加入1 mL 70%乙醇，13 000 r/min离心1 min，弃上清，再加入1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，13 000 r/min离心1 min，除去残留的乙醇，待沉淀干燥。

1.3枣树及植原体DNA-CsCl溶液的制备

将DNA沉淀小心溶解于适量的 CsCl溶液（1.4 g/mL CsCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0）中，将DNA-CsCl∶双苯酰亚胺=2∶1温和混匀，避光过夜，用数字阿贝折射仪（WAY-2S，上海仪电物理光学仪器有限公司）调节溶液的折射率[5]。

1.4枣疯病植原体DNA的富集

利用Beckman Optima MAX-XP台式超速离心机，MLA-55转头，20℃、52 000 r/min下离心48 h，小心取出离心管，置于UV 365 nm下拍照观察。用注射器吸取离心管中的目的条带至50 mL离心管中，紫外分光光度法测量DNA浓度，再次按DNA-CsCl∶双苯酰亚胺=2∶1染色，用数字阿贝折射仪调节溶液的折射率，20℃、52 000 r/min下离心48 h，小心取出离心管，置于UV 365 nm下再次观察收集。

1.5枣疯病植原体DNA的纯化

向吸取的植原体DNA溶液组分中加入等体积的异丙醇，缓慢颠倒几次，分层后小心去掉上层溶液，重复这一过程直到将离心管暴露于紫外灯下观察不到荧光。加2.5倍体积的80%乙醇，室温下16 060×g离心20 min，沉淀植原体DNA，弃上清液，70%乙醇洗涤并干燥两次，用适量的水溶解，紫外分光光度法测量DNA浓度[7]。

1.6分离纯化效果分析

以枣疯病植原体的16S rDNA序列为模板设计用于扩增枣疯病植原体DNA的PCR引物[8]，以枣树的26S rDNA序列为模板设计用于扩增枣树DNA的PCR引物，如表1所示。将富集纯化前后感病枣树总DNA浓度稀释为10、1 ng/μL和100、10、1、0.5、0.25、0.125 pg/μL，以其为模板进行PCR扩增。PCR程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55～59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃再延伸10 min。

2结果与分析

2.1超速离心法分离纯化枣疯病植原体DNA

采用CTAB法提取健康枣树和感染枣疯病枣树叶片总DNA，将提取的DNA与CsCl、双苯酰亚胺溶液混匀，20℃、52 000 r/min离心48 h后，置于UV 365 nm下拍照观察。如图1所示，健康植株离心管中只有一条荧光条带，而枣疯病植株离心管中有两条荧光条带，一条与健康植株DNA条带位置相同，另一条约在健康植株DNA条带上方1 cm处，位于上方的条带即为枣疯病植原体DNA。

用注射器小心地吸取枣疯病植株离心管上方的枣疯病植原体DNA条带至50 mL离心管中，紫外分光光度法测量DNA浓度后，再次按DNA-CsCl∶双苯酰亚胺=2∶1染色，用数字阿贝折射仪调节溶液的折射率，20℃、52 000 r/min离心48 h，置于UV 365 nm下再次观察收集。如图1所示，枣疯病植株离心管中只有一条荧光条带，位置约在健康植株DNA条带上方1 cm处，这表明枣疯病植原体DNA条带位置较稳定，且收集到的枣疯病植原体DNA溶液中已很少有寄主植株的DNA存在。利用紫外分光光度计测定富集纯化后感病枣树总DNA浓度为203 ng/μL。

.2分离纯化效果分析

分别以富集纯化前后感病枣树总DNA为模板，利用引物对JWB-F/JWB-R和26S rDNA-F/26S rDNA-R进行PCR扩增，结果如图2所示，模板浓度为10 ng/μL时，两种DNA模板的26S rDNA的电泳条带亮度基本一致，但纯化后的枣疯病植原体总DNA的JWB电泳条带亮度明显高于纯化前。模板浓度为1 ng/μL时，纯化后的枣疯病植原体总DNA模板的26S rDNA的电泳条带亮度低于纯化前，但纯化后的枣疯病植原体总DNA的JWB电泳条带亮度仍明显高于纯化前，这表明通过氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法分离纯化后的枣疯病植原体总DNA中寄主植株的DNA含量明显减少。

M：天根DNA Marker Ⅰ；1～3：模板浓度10 ng/μL下的16S rDNA条带；1：未纯化DNA；2：纯化后DNA；3：阴性对照；4～6：模板浓度10 ng/μL下的26S rDNA条带；4：未纯化DNA；5：纯化后DNA；6：阴性对照；7～9：模板浓度1 ng/μL下的16S rDNA条带；7：未纯化DNA；8：纯化后DNA；9：阴性对照；10～12：模板浓度1 ng/μL下的26S rDNA条带； 10：未纯

为了进一步定量分析超速离心纯化效果，分别以不同稀释度的富集纯化前后感病枣树总DNA为模板进行Real-time PCR，结果如表2所示，当模板浓度为1 ng/μL时，纯化后的枣疯病植原体总DNA中26S rDNA相对纯化前的量为0.0638，而JWB相对纯化前的量为0.5035。该结果表明，采用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法可以有效地从感染枣疯病的枣树总DNA中分离纯化枣疯病植原体DNA。

3讨论与结论

枣树是我国一种重要的经济作物。由于枣疯病的毁灭性威胁，导致枣产量遭受巨大损失，20世纪70—80年代，河北玉田和北京密云等地的金丝小枣曾绝产绝收[9]。因此，进一步了解和防治枣疯病已迫在眉睫，而植原体全基因组测序研究对认识和防治此类病害具有重要意义。

本研究采用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度超速离心法分离纯化植原体的基因组DNA，该方法简便易行，是目前应用较多的一种方法[5，10]。不同氯化铯初始密度对DNA的分离效果具有非常明显的影响，条带位置随氯化铯初始密度大小的变化而改变，密度越大，条带位置越靠近离心管口。当氯化铯初始密度过低时，植原体与植物基因组DNA聚集在离心管底部，不能达到分离的效果。陈昱圻等[8]报道氯化铯初始密度为1.5622 g/cm3，折射率为1.3871时分离效果最佳，而本试验中达到最佳分离效果的折射率为1.3942，这可能与超速离心时的转速、离心管的型号等多种因素不同有关。此外，DNA终浓度不同也会引起不同的分离效果，Tran-Nguyen等[5]研究表明，DNA终浓度最好不要超过100～150 μg/mL，DNA终浓度过高会使寄主植物的DNA条带较宽，甚至完全覆盖植原体DNA的条带，导致不能使植原体DNA从寄主植物基因组DNA中分离出来。本试验通过对一系列不同DNA终浓度的探索发现，在DNA终浓度为120 μg/mL时分离效果最佳，这与Tran-Nguyen等研究结果一致。

本研究结合Real-time PCR对氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度超速离心法的分离纯化效果进行评估，结果表明该方法可以有效地从感染枣疯病的枣树DNA中分离纯化出枣疯病植原体DNA，这为制备高纯度的植原体DNA和枣疯病植原体全基因组测序提供了方法参考。

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收稿日期：2017-09-12

基金项目：山东省重点研发计划項目（2015GNC110026）；山东省农业科学院青年基金项目“双孢菇多肽的制备及其生物活性研究”

作者简介：弓志青（1976—），女，博士，副研究员，从事果蔬加工研究。E-mail：gongzq413@tom.con

通讯作者：王文亮（1980—），男，硕士，副研究员，从事食用菌加工研究。E-mail：cywwl@163.com