牛分枝杆菌esat6和cfp10蛋白的表达及在临床检测中的应用

解晓莉+韩猛+刘来兴+王基隆+杨美+张云飞+丁家波+张亮+杨宏军

摘要：本研究以牛分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增esat6和cfp10基因，构建重组表达载体pET-32a（+）-esat6和pET-32a（+）-cfp10，并通过原核表达系统分别表达重组esat6和cfp10蛋白，经Ni-NTA亲和层析法纯化后，对目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证，BCA法测定目的蛋白浓度，最后将east6和cfp10蛋白混合后用于牛结核病临床检测，并对检测数据进行分析。结果表明，牛分枝杆菌esat6和cfp10蛋白在大肠杆菌系统中获得高效表达；其混合蛋白应用于结核病检测具有较高的特异性，且在皮肤变态反应和IFN-γ释放试验两种检测方法中具有较高的符合率。说明相较于提纯结核菌素（PPD），esat6和cfp10混合蛋白具有较高的特异性和稳定性，将有希望替代PPD用于牛结核病检测。

关键词：牛分枝杆菌；esat6和cfp10蛋白；皮肤变态反应；IFN-γ释放试验

中图分类号：S858.23文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）11-0120-04

Expression and Clinical Significance of

Mycobacterium bovis esat6 and cfp10 Protein

Xie Xiaoli1， Han Meng1， Liu Laixing1， Wang Jilong1， Yang Mei1，

Zhang Yunfei1， Ding Jiabo2， Zhang Liang1， Yang Hongjun1

（1. Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250000， China；

2. China Institute of Veterinary Drugs Control， Beijing 100081， China）

AbstractIn this study， the esat6 and cfp10 gene were cloned with genomic DNA of Mycobacterium bovis strain H37Rv as template. Recombinant expression vectors pET-32a（+）-esat6 and pET-32a（+）-cfp10 were constructed to express esat6 and cfp10 protein through the prokaryotic expression system. The recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography and verified with SDS-PAGE and Western blot. Furthermore， the protein concentrations were determined with BCA method. Then the two proteins were mixed to detect the BTB （bovine tuberculosis） and the results were analyzed. The results showed that esat6 and cfp10 protein were highly expressed in E. coli. There were high specificity and coincidence rate in skin allergic reaction and IFN-γ release test using mixed protein as stimulator. This study confirmed that compared with PPD， esat6 and cfp10 mixed protein had higher specificity and stability and was a promising alternative in BTB detection.

KeywordsMycobacterium bovis； esat6 and cfp10 protein； Skin allergic reaction； IFN-γ release test

牛結核病（bovine tuberculosis）是由牛型分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，在世界各国均有发生[1]。OIE将该病列为B类动物疫病，其广泛传播流行，直接影响着畜牧业的发展，威胁人类健康，危害公共卫生安全[2]。目前牛结核病的诊断方法主要有提纯结核菌素（PPD）皮肤变态反应及IFN-γ释放试验。然而，由于PPD与卡介苗（BCG）及部分环境分枝杆菌存在抗原交叉，所以特异性较低，为了排除交叉反应的干扰，近年的研究更倾向于寻找特异性抗原。

esat6、cfp10是牛分枝杆菌的主要毒力因子，能够诱导宿主细胞的凋亡，同时还是重要的T细胞抗原，能够诱导机体产生记忆性免疫应答[3]。基因组学研究证实，esat6、cfp10均位于RD1区，该区仅存在于MTB等致病性分枝杆菌中，而不存在于BCG及其它非致病性分枝杆菌中[4，5]，因此可以排除交叉反应，其作为诊断性抗原具有更好的特异性。esat6、cfp10作为分子伴侣以异二聚体的形式从胞内分泌出来，这种结构与蛋白质活性有密切关系，本试验把两者按照1∶1的比例进行混合更符合牛分枝杆菌的生物学特性，这也在一定程度上提高了其作为诊断抗原的敏感性。本研究通过原核表达系统表达esat6和cfp10蛋白，并将其以1∶1的比例混合后用于牛结核病临床检测，以评价其检测应用价值。

1材料与方法

1.1材料与试剂

牛分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA由中国兽医药品监察所提供；pEASY-T3克隆载体、感受态DH5α、BL21（DE3）、蛋白质Marker均购自北京TransGen Biotech；pET-32a（+）由本实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及DNA Marker均购于大连宝生物工程有限公司；Anti-His antibody（His-2）购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；DNA回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自北京TianGen Biotech ；其余试剂为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1目的基因克隆根据NCBI中esat6和cfp10基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计两对引物，由上海生工技术有限公司合成。其中esat-6上游序列为：5′-ccggatccatgacagagcagtggaatttcg-3′（划线处为BamH Ⅰ酶切位点），下游序列为：5′-cggaattctgcgaacatcccagtgacgttg-3′（划线处为EcoR Ⅰ酶切位点）；cfp-10上游序列为：5′-cggaattcgcagagatgaagaccgatgc-3′（划线处为EcoR Ⅰ酶切位点），下游引物序列为：5′-ggaagctttcagaagcccatttgcgag-3′（划线处为Hind Ⅲ酶切位点）。

以牛分枝菌标准株H37Rv基因组DNA为模板，扩增esat6和cfp10基因，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接至pEASY-T3载体，转化感受态DH5a，进行蓝白斑筛选扩大克隆，抽提重组质粒进行双酶切鉴定[6]，阳性质粒分别命名为pEASY-T3-esat6和pEASY-T3-cfp10并送上海生工有限公司测序。

1.2.2重组esat6蛋白和cfp10蛋白的表达与鉴定重组质粒和pET-32a（+）质粒经相应限制性内切酶酶切处理后，连接转化至BL21。经酶切和测序鉴定，将阳性菌株分别命名为pET32a（+）-esat6/BL21和pET32a（+）-cfp10/BL21。取陽性菌株培养，经IPTG（终浓度为0.5 mmol/L）30℃诱导6 h，同时设空载体对照。10 000 r/min离心10 min收集菌体，经超声裂解后离心收集上清，进行SDS-PAGE鉴定，同时利用His单抗进行Western blot分析。

1.2.3esat6和cfp10蛋白纯化与浓度测定利用Ni-NTA亲和层析法对His-esat6和His-cfp10蛋白进行纯化，并通过SDS-PAGE对其纯化效果进行鉴定。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）对纯化蛋白浓度进行测定。

1.2.4esat6和cfp10在临床诊断中的应用将纯化得到的目的蛋白用 HanksBalanced Salt Solution稀释至终浓度为50 μg/mL，分装，-80℃冻存。挑选50头健康的荷斯坦泌乳牛，分别颈部注射结核菌素（50 μg/mL）和esat6+cfp10混合蛋白（esat6∶cfp10=1∶1，esat6和cfp10浓度均为25 μg/mL）进行皮肤变态反应试验，同时观察牛颈部的炎症反应，筛选出的阳性牛和可疑牛采集抗凝血进一步开展IFN-γ试验。皮肤变态反应操作方法及判定标准参照《动物结核病诊断技术（GB/T 18645—2002）》。

1.3检测数据分析

将收集的检测数据利用Kappa系数进行统计学分析。

2结果与分析

2.1esat6和cfp10基因的PCR扩增

以牛分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板，分别扩增得到288 bp和303 bp的预期大小片段（图1）。

2.2esat6和cfp10重组质粒的鉴定

esat6和cfp10重组质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ﹑HindⅢ双酶切鉴定，分别得到288 bp和303 bp的目的片段，BLSAT比对结果显示两基因与NCBI公布的相应序列同源性均为100%，两基因重组质粒均构建正确（图2）。

重组质粒的酶切鉴定

2.3His-esat6和His-cfp10蛋白的表达与鉴定

将原核表达产物经SDS-PAGE（图3A）与Western blot（图3B）分析显示，His-esat6和His-cfp10蛋白均已表达，且大小与预期大小（分别为28 kD和29 kD）一致。

2.4esat6和cfp10蛋白的浓度测定

利用试剂盒中的蛋白标准品制作标准曲线（图4），根据方程y=0.2317x+0.1249及目的蛋白的OD值0.228和0.352，得到esat6和cfp10蛋白含量分别为：444.97 μg/mL和980.15 μg/mL。

2.5esat6和cfp10在临床诊断中的应用

将待检测蛋白进行牛颈部注射后72 h进行复检，阳性牛肉眼可见注射部位肿胀坚硬，触摸敏感。在皮肤变态反应中，PPD的阳性检出率为38%，混合蛋白的阳性检出率为30%。Kappa系数分析显示，在以混合蛋白及提纯结核菌素作为刺激剂的皮肤变态反应和IFN-γ释放试验中，两两间均具有显著相关性。不同刺激物和不同检测方法的符合率均较高（表1）。

3讨论

牛结核病是一种慢性消耗性传染病，呈世界流行性，且无明显季节性，在流行严重的地区感染率可达60%[7]。esat6和cfp10抗原仅存在于致病性分枝杆菌的早期培养滤液中，没有信号肽，是两种非信号肽依赖的结核分枝杆菌分泌性小分子量抗原[8]，能诱导机体产生高水平IFN-γ[9]和强烈的DTH反应[10]，在牛结核病的诊断、预防中起着重要作用。east6和cfp10从胞内分泌时形成1∶1紧密的异二聚体结构，这种结构有利于调控蛋白活性，增加蛋白与蛋白之间相互作用的特异性[8]。因此，本研究在试验过程中对esat6与cfp10按照1∶1的比例进行混合，以发挥两者最大的生物学功能，提高检测的灵敏性。

对牛只进行皮肤变态反应试验，检测结果显示，PPD的阳性检出率为38%，而esat6和cfp10混合蛋白的阳性检出率为30%，且两者具有高达92%的整体符合率，这表明PPD检测可能具有较强的敏感性，阳性检出率较高，但PPD是全菌蛋白的抽提物，成分复杂，与卡介苗（BCG）及环境中其它分枝杆菌存在抗原交叉反应[11]，检测假阳性的风险较大。从IFN-γ释放试验的结果分析，PPD作为刺激物的皮肤变态反应与IFN-γ释放试验的符合率为78.95%，而以esat6和cfp10混合蛋白作为刺激物的皮肤变态反应与IFN-γ释放试验的符合率为89.47%，这表明esat6和cfp10的可重复性、特异性更高，检出结果更符合牛群的感染状况。这也从侧面反映了PPD作为检测抗原存在较高的假阳性，与Aagaard等[12]的研究结论相符合。

虽然IFN-γ分泌的灵敏度能够达到pg级[13]，特异性也高达100%，同时IFN-γ释放试验作为牛结核病诊断的最佳方法，是皮肤变态反应无法比拟的，但是IFN-γ释放试验的体外操作过程复杂，作为临床快速诊断试剂应用有一定的局限性；而PPD作为检测抗原存在较高的假阳性；若能将esat6和cfp10混合蛋白替代PPD，可以提高诊断的特异性，降低检测的假阳性率，这必将有良好的应用前景。

参考文献：

[1] 蔡宝祥. 家畜传染病学[M]. 第四版.北京： 中国农业出版社， 2001：110-111.

[2]Pollock J M， Welsh M D， McNair J. Immune responses in bovine tuberculosis： towards new strategies for the diagnosis and control of disease[J]. Vet. Immunol. Immunop.， 2005， 108（1）： 37-43.

[3]Skjt R L， Oettinger T， Rosenkrands I， et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens[J]. Infect Immun.， 2000， 68（1）： 214-220.

[4]Mahairas G G， Sabo P J， Hickey M J， et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis [J]. J. Bacteriol.， 1996， 178（5）： 1274-1282.

[5]Joung S M， Jeon S J， Lim Y J， et al. Complete genome sequence of Mycobacterium bovis BCG Korea， the Korean vaccine strain for substantial production[J]. Genome Announc.， 2013， 1（2）： e0006913.

[6]萨姆布鲁克J，拉塞尔D W. 分子克隆实验指南 [M]. 第三版. 黄培堂等译. 北京： 科学出版社， 2008.

[7]刘思国， 王春来， 张秀华，等. 牛结核病病原生态学和流行病学研究[J].中国畜牧兽医， 2005， 32（3）： 60-62.

[8]Sorensen A L， Nagai S，Hoven G， et al. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis[J]. Infect Immun.， 1995， 63（5）： 1710-1717.

[9]Colangeli R， Spencer J S， Bifani P， et al. MTSA10， the product of the Rv3874 gene of Mycobacterium tuberculosis， elicits tuberculosis-specific， delayed-type hypersensitivity in guinea pigs[J]. Infect Immun.， 2000， 68（2）： 990-993.

[10]Philipp W J， Nair S， Guglielmi G， et al. Physical mapping of Mycobacterium bovis BCG Pasteur reveals differences from the genome map of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and from Mycobacterium bovis [J]. Microbiology， 1996， 142（11）：3135-3145.

[11]Michae D， Welsh， Rodat T， et al. Influence of pathological progression on the balance between cellular and humoral immune responses in bovine tuberculosis[J]. Immunology， 2004， 114（1）： 101-111.

[12]Aagaard C， Govaerts M， Meikle V， et al. Optimizing antigen cocktails for detection of Mycobacterium bovis in herds with different prevalences of bovine tuberculosis： ESAT6-CFP10 mixture shows optimal sensitivity and specificity [J]. J. Clin. Microbiol.， 2006， 44（12）： 4326-4335.

[13]Fine P E， Sterne J A， Ponnighaus J M， et al. Delayed-type hypersensitivity reaction mycobacterial vaccines and protective immunity[J]. Lancet， 1994， 344 （8932）： 1245-1249.山 东 农 业 科 学2017，49（11）：124～126，161Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第49卷第11期李福伟，等：LED灯对蛋鸡生产性能的影响及节能效果分析DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.11.024

收稿日期：2017-09-02

基金项目：国家现代蛋鸡产业技术体系济南综合试验站项目（CARS-40-S12）；鸡蛋生产质量安全控制技术研究与示范（201608）；畜禽健康养殖关键技术研究（CXGC2017B02）；济南市畜牧科技与良种推广能力建设项目“蛋鸡标准健康养殖技术”；山东省财政支持农业技术推广项目“蛋鸡标准化健康养殖技术推广”

作者简介：李福伟（1977—），男，副研究员，硕士，主要从事家禽育种与生产技术研究。E-mail：lifuwei1224@163.com

通讯作者：黄保华（1964—），男，研究员，本科，主要從事家禽营养学研究。E-mail：jqsyzs@163.com