3种三萜类化合物对黄胸散白蚁生物活性及纤维素酶的影响

徐伟丽+韩萌+袁忠林

摘要：为明确马缨丹叶片中分离提纯的马缨丹酸、马缨丹烯A和马缨丹烯B 3种三萜类化合物对白蚁的毒杀活性及对其体内纤维素酶的影响，采用滤纸片饲喂法测定了3种化合物对黄胸散白蚁的毒杀作用，并用酶标仪测定了不同浓度、不同处理时间白蚁体内内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BGL）活性。结果表明，3种三萜类化合物对白蚁具有一定的毒杀作用。酶活性测定表明，不同浓度马缨丹酸处理黄胸散白蚁12～72 h，白蚁体内的EG、CBH、BGL活性均有不同程度的变化，其对白蚁体内EG活性总体有抑制作用，2 mg/mL在12～36 h抑制作用最为显著；对CBH活性则有一定的促进作用，2 mg/mL 对CBH活性促进作用较为明显，但与对照相比差异不显著；对BGL活性则表现为抑制作用。马缨丹烯B和马缨丹烯A对黄胸散白蚁体内3种酶活性均表现为抑制作用，且随浓度的增大抑制作用显著。因此，3种三萜类化合物对黄胸散白蚁体内的纤维素酶活性均有一定影响，尤其是马缨丹烯B、A抑制作用较强，它们对3种酶活性的影响与浓度和时间有关。

关键词：马缨丹；马缨丹酸；马缨丹烯A；马缨丹烯B；黄胸散白蚁；纤维素酶；生物活性

中图分类号：S433文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）11-0098-07

Effects of 3 Triterpenoids on Bioactivity and Cellulase

Activity of Reticulitermes flaviceps （Isoptera： Rhinotermitidae）

Xu Weili， Han Meng， Yuan Zhonglin

（College of Plant Health and Medicine， Qingdao Agricultural University/Key Laboratory of

Integrated Crop Pest Management of Shandong Province， Qingdao 266109， China）

AbstractIn order to define the bioactivity and effects on the cellulose activity of termite， three triterpenoids， lantanolic acid， lantadene A and B， which isolated and purified from leaves of Lantana camara， were used to feed Reticulitermes flaviceps by filter paper method. The activities of 3 enzymes of endo-1，4-β-glucanase （EG）， exo-β-1，4-glucanase（CBH） and β-1，4-glucosidase （BGL） in termite were tested with ELIASA at different concentrations and treatment times. The results showed that the 3 triterpenoids all had certain toxic activity on termite. The enzyme activity test showed that EG， CBH and BGL all had different changes when treated with lantanolic acid for 12～72 hours. In general， lantanolic acid had an inhibitory effect on EG， and it was significant at the concentration of 2 mg/mL in 12～36 hours. Lantanolic acid had certain active effect on CBH， and the effect of 2 mg/mL was more obvious， but it was not significantly different compared with control. On BGL， lantanolic acid showed an inhibitory effect. Lantadene A and B showed inhibitory effects on all three kinds of enzymes， and the inhibitory effects became significant with the increase of concentration. Therefore， three triterpenoids all had certain effects on the cellulase activity in Reticulitermes flaviceps which depended on the concentration and treatment time， especially the inhibitory effect of lantadene B and A.

KeywordsLantana camara； Lantanolic acid； Lantadene A； Lantadene B； Reticulitermes flaviceps； Cellulase； Bioactivity

白蟻（termite）是世界性五大害虫（须舌蝇、蜱、蚊子、粘虫和白蚁）之一，总数不少于2 500种，遍布全世界，特别是热带、亚热带国家，为害面积约占全球总面积的50%[1]。白蚁为害十分广泛，如房屋建筑、园林绿化苗木、铁道枕木、船舶桥梁、江河堤围、水库土坝、地下电缆、经济林木、名胜古迹、仓库物资、文物档案、家具衣服、室内装饰物等。不仅如此，白蚁对非纤维素物质如塑料、橡胶、沥青、金属等也常常进行蛀蚀为害。在美国，每年因地下白蚁为害造成的损失和维修建筑费用已超过火灾、地震、龙卷风和其它自然灾害损失的总和[2]。

白蚁的一个明显特征就是食木性，取食范围极广，包括木材（完好的或已腐解的）、植物叶片、腐殖质、杂物碎屑以及食草动物粪便等。白蚁消化系统内存在完整的纤维素酶体系。白蚁后肠结构复杂，分为P1～P5区，其中P3区显著膨大，栖息着大量微生物，可降解纤维素和半纤维素，发酵产生短链脂肪酸供白蚁营养[3，4]。根据酶的性质与功能，可将纤维素酶分成内切葡聚糖酶（endo-1，4-β-glucanase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BGL）。内切葡聚糖酶主要作用于非结晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物，随机水解糖苷键，将其分解成葡葡糖或纤维二糖、纤维三糖和其他寡聚糖。外切葡聚糖酶包括纤维二糖水解酶（1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase，CBH）[5]和外葡萄糖水解酶（1，4-β-D-glucanglucohydrolase），分别作用于晶状纤维素和可溶性纤维糊精，从多聚糖链的非还原端释放出纤维二糖和葡萄糖。β-葡萄糖苷酶（BGL）将纤维二糖和水溶性纤维糊精水解成葡萄糖[6，7]。

近年来，由于化学杀虫剂的长期滥用，白蚁抗药性迅速提高，猖獗危害问题日益突出，对生物、人类健康以及环境也带来大量问题，因此，有关学者更加重视对人类健康和环境影响小的天然杀虫剂的研究[8]。某些高等植物的代谢产物有抗菌和杀虫的生物活性，这些高等植物可成为良好的生物资源[9，10].

本实验室前期研究结果表明，马缨丹叶片提取物对黄胸散白蚁（Reticulitermes flaviceps）具有拒食和毒杀活性[11]，马缨丹精油对黄胸散白蚁具有拒避和触杀作用[12]，但具体作用机理尚不明确。为探究马缨丹地上部分精油化合物对黄胸散白蚁的作用机理，本试验探究了马缨丹叶片提取物的3种三萜类化合物对黄胸散白蚁的毒杀活性及体内纤维素酶活性的影响，以明确其生物活性及初步作用机理。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供試植物马缨丹叶片，于2013年8月采自福建省福州市，阴干粉碎，装入自封塑料袋中于4℃冰箱保存备用。

1.1.2供试害虫黄胸散白蚁，采自山东省青岛崂山，放在滤纸保持湿润的保鲜盒（体积为11 cm×17 cm×6 cm）内饲养，并将保鲜盒放入相对湿度为98%、温度25℃的人工气候箱内培养。

1.2试验试剂

马缨丹酸（lantanolic acid）、马缨丹烯A（lantadene A）和马缨丹烯B（lantadene B），均由本实验室从马缨丹中提取、分离与鉴定，纯度为100%。羟甲基纤维素（天津市巴斯夫化工有限公司，含量为98%）；微晶纤维素（成都市科隆化工试剂厂，含量为99%）；水杨酸（天津博迪化工有限公司，含量为98%）；乙酸钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，含量>99%）；DNS（3，5-二硝基水杨酸，上海展运化工有限公司）；氢氧化钠（天津鼎盛新化化学试剂厂，含量>96%）；酒石酸（天津市红岩化学试剂厂，含量>99%）；苯酚（北京化工有限公司，含量为99%），葡萄糖、丙酮、甲醇等均为分析纯。

1.3试验方法

本试验先通过毒杀试验明确3种三萜类化合物对黄胸散白蚁的毒杀作用，确定合适的试验浓度，并在试验结束后对白蚁取食过的滤纸片进行称重，初步确定对白蚁的拒食作用；用合适的试验浓度通过胃毒作用处理黄胸散白蚁，在不同的处理时间进行取样，测定3种三萜类化合物对黄胸散白蚁纤维素酶活性的影响。

1.3.13种三萜类化合物对黄胸散白蚁的毒杀活性测定毒杀作用测定方法参照文献[14]的方法，并加以改进。将直径为35 mm的滤纸片，均匀滴加100 μL不同浓度3种化合物丙酮药液（马缨丹酸、马缨丹烯A、马缨丹烯B浓度均设为2、1、0.5 mg/mL），使滤纸片中化合物浓度分别为20、10、5 μg/cm2，滴加100 μL丙酮处理的滤纸片为溶剂对照，滴加清水处理的滤纸片为空白对照。通风橱内放置24 h，待丙酮溶剂挥发后称重，用100 μL蒸馏水湿润滤纸片，分别放入6孔培养板内，每孔接入30头白蚁，放于人工气候箱内（25℃、相对湿度98%）黑暗条件下培养。每天统计存活白蚁数，10 d后结束试验，对滤纸片干燥后称重，统计白蚁死亡率。每处理重复3次。

1.3.2黄胸散白蚁纤维素酶的测定

①黄胸散白蚁的处理方法

参照文献[13]进行。将直径为35 mm的滤纸片，均匀滴加100 μL不同浓度3种化合物丙酮药液（马缨丹酸、马缨丹烯A、马缨丹烯B浓度均设为2、1、0.5 mg/mL），丙酮处理为溶剂对照。待丙酮溶剂挥发后称重，用100 μL蒸馏水湿润滤纸片，分别放入6孔培养板内，每孔接入50头白蚁（白蚁处理的培养孔数根据试验需要设定），放于人工气候箱内（25℃、相对湿度98%）。分别于处理后12、24、36、48、72 h从培养皿内取出活虫进行酶活性测定。

②黄胸散白蚁体内纤维素酶粗酶液的提取

参照文献[14]进行测定。取不同处理的白蚁成年工蚁20 mg，用0.1 mol/L Hac-NaAc缓冲液（SAB，pH 5.6）反复多次漂洗。然后放入研钵中，分步加入1.0 mL SAB缓冲液（pH 5.6）在冰浴条件下进行研磨。4℃、12 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，即为反应的粗酶液。把提取的粗酶液保存在-20℃冰箱中备用。测定时用SAB缓冲液（pH 5.6）稀释5倍。

③ 葡萄糖标准曲线及回归方程[15]

配置1 mg/mL葡萄糖标准溶液，按照表1所示进行反应，以1号试管反应为对照，在OD540nm下记录各管吸光值，以所测吸光值为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制葡萄糖标准曲线（图1）。

④内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BGL）活性测定

黄胸散白蚁体内纤维素酶测定方法按照许利霞[16]、张时妙等[17]的方法，并加以改进。

内切葡聚糖酶活性测定：以0.1 mol/L SAB缓冲液（pH 5.6）为溶剂，1%（W/V）羟甲基纤维素（carboxymethylcellulose，CMC-Na）为底物，取950 μL底物与50 μL酶液充分混合，在35℃条件下水浴加热15 min，加入1.00 mL DNS终止反应，沸水浴加热5 min，水解产生的还原糖通过微量法进行测定，通过酶标仪MultiskanMK3（上海赛默飞世尔仪器有限公司）检测540 nm下的吸光值，设3个重复。

外切葡聚糖酶活性测定：以0.1 mol/L SAB缓冲液（pH 5.6）为溶劑，1%（W/V）微晶纤维素（microcrystalline cellulose）溶液为底物，取950 μL底物与50 μL酶液充分混合，在35℃条件下水浴加热15 min，加入1.00 mL DNS终止反应，沸水浴加热5 min，水解产生的还原糖通过微量法进行测定，通过酶标仪检测540 nm下的吸光值，设3个重复。

β-葡萄糖苷酶活性测定：以0.1 mol/L SAB缓冲液（pH 5.6）为溶剂，0.6%（W/V）水杨酸（salicin）溶液为底物，取950 μL底物与50 μL酶液充分混合，在35℃条件下水浴加热15 min，加入1.00 mL DNS终止反应，沸水浴加热5 min，水解产生的还原糖通过微量法进行测定，通过酶标仪检测540 nm下的吸光值，设3个重复。

⑤酶活力单位定义

纤维素酶活力单位定义采用国际酶学委员会规定的国际单位U，即在特定条件下，每分钟底物产生1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）[18]。

酶活（U）=[生成葡萄糖的量（mg）×稀释倍数]/[反应时间（min）×0.18 mg/μmol×所用酶量（mL）]。

1.4数据分析方法

采用SPSS对数据进行分析，并用Microsoft Excel软件对数据进行处理和作图。

2结果与分析

2.1马缨丹叶片三萜类化合物对黄胸散白蚁的毒杀活性测定结果

取食不同浓度三萜类化合物处理的滤纸片10 d后，对黄胸散白蚁都有一定的毒杀作用，均随着浓度增加毒杀效果增加（图2）。在最高浓度20 μg/cm2时，3种化合物对黄胸散白蚁的毒杀作用相差不大，黄胸散白蚁的死亡率基本都在30%左右。3种化合物不同浓度处理对白蚁的毒杀效果均显著高于溶剂（丙酮）对照和空白（水）对照处理（P<0.05），而两对照间差异不显著（P>0.05）。马缨丹酸3种浓度处理间差异不显著（P>0.05），马缨丹烯A和B 3个浓度处理间差异显著（P<0.05）。

黄胸散白蚁对3种化合物不同浓度处理滤纸片的消耗量结果显示（图3），较高浓度马缨丹酸对黄胸散白蚁有明显的拒食活性，并且随着浓度的增加，滤纸消耗量减少，拒食作用增强（P<0.05）；马缨丹烯A和B对黄胸散白蚁拒食作用不显著 （P>0.05）。

2.23种三萜类化合物对黄胸散白蚁体内3种纤维素酶活性的影响

2.2.1马缨丹酸对黄胸散白蚁体内3种纤维素酶活性的影响不同浓度马缨丹酸处理12～72 h后，黄胸散白蚁体内的EG、CBH、BGL均有不同程度的变化（表2），溶剂对照和空白对照均无显著差异，从总体来看，3种酶的活性不同程度受到抑制。马缨丹酸处理12 h时，EG活性显著低于对照，0.5、1、2 mg/mL处理相较溶剂CK，抑制率分别为1.77%、13.27%和42.48%；处理24 h时，除2 mg/mL对EG抑制率降低26.32%外，其他浓度处理酶活性均无显著变化；处理36 h时对EG活性均具有显著的抑制作用，0.5、1、2 mg/mL处理的抑制率分别为30.09%、30.09%、25.66%；不同浓度的马缨丹酸在处理48、60 h对EG活性均无显著影响；72 h时除0.5 mg/mL显著降低了酶活性外，其他浓度对酶活性均无显著影响（P> 0.05）。

处理12 h时，0.5、1 mg/mL马缨丹酸均能抑制CBH活性，相较溶剂CK，抑制率分别为10.68%和14.53%，但2 mg/mL则有一定的促进作用，与对照差异不显著；24 h时3种浓度均提高了CBH活性，1、2 mg/mL处理分别提高了74.62%和77.69%，而0.5 mg/mL对CBH活性无显著影响；处理36、72 h时不同浓度马缨丹酸对CBH活性也表现为促进作用，但无显著变化；48、60 h时，除1 mg/mL处理对CBH活性有显著抑制作用外，其他浓度对CBH有一定的促进作用，但差异不显著。

马缨丹酸对BGL总体表现为抑制作用，在12、48、72 h对BGL无显著影响。在24 h时只有2 mg/mL显著抑制了BGL活性，相较溶剂CK，抑制率为15.67%；36 h时0.5、1 mg/mL显著抑制了BGL活性，抑制率分别为13.29%和13.99%。60 h时只有 0.5 mg/mL处理显著抑制了BGL活性，抑制率为20.59%。

2.2.2马缨丹烯B对黄胸散白蚁体内3种纤维素酶活性的影响不同浓度马缨丹烯B处理白蚁后，对其体内酶活性均有不同程度影响（表3）。0.5 mg/mL马缨丹烯B对白蚁体内EG在所有时间内与对照均无显著差异（P>0.05）。在12、24、36、60 h时，只有2 mg/mL处理显著抑制了EG活性，相较溶剂CK，抑制率分别为38.98%、27.78%、17.50%和26.38%；在48、72 h只有1、2 mg/mL对EG具有显著抑制作用，抑制率分别为14.63%、23.58%和37.72%、38.32%。

马缨丹烯B对CBH在12 h时无显著影响，但其他时间有不同抑制作用，且随着浓度的增加抑制作用增大。24 h时，0.5、1、2 mg/mL处理对CBH均有显著抑制作用，相较丙酮处理，其抑制率分别为6.12%、10.20%和52.86%；36 h时，其抑制率分别是2.00%、5.99%和6.61%，但0.5 mg/mL对CBH的影响与对照差异不显著。在48 h时，只有2 mg/mL对CBH有显著的抑制作用，抑制率为11.40%。60、72 h时，1、2 mg/mL对CBH均有显著抑制作用，抑制率分别为19.16%、27.42%和39.91%和42.92%。

马缨丹烯B对BGL活性的影响也与其他酶相似。12、24、36 h时，虽然0.5、1、2 mg/mL都对BGL活性有抑制作用，但只有2 mg/mL处理抑制作用显著，抑制率分别为30.33%、30.37%和26.09%。48 h时，1、2 mg/mL对BGL有显著的抑制作用，抑制率分别为13.53%和27.65%。60 h时，0.5、1、2 mg/mL对BGL均有显著抑制作用，抑制率分别为13.33%、8.89%和23.70%。72 h时只有2 mg/mL对BGL抑制作用显著，抑制率为19.26%。3讨论与结论

有研究表明，白蚁通过自身分泌或者体内共生物分泌的纤维素酶消化纤维素类食物，并能消化木质材料的纤维素达到74%～99%[19，20]。白蚁体内的纤维素酶主要成分是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，3种酶在白蚁体内的作用部位不同，但都是将木质纤维素降解为可以完全被自身吸收利用的营养物质[21]。孙骊珠等[22]研究表明，马缨丹不同溶剂提取物对黄胸散白蚁体内纤维素酶活性具有不同程度的抑制作用。本研究结果表明，马缨丹叶片中的3种三萜类化合物对白蚁有一定毒杀作用，能够抑制其体内3种纤维素酶的活性，且随着浓度的增大抑制作用增强。黄胸散白蚁对不同浓度化合物处理滤纸片的消耗显示，较高浓度（20、10 μg/cm2）的马缨丹酸处理对黄胸散白蚁具有一定的拒食作用，其他化合物及浓度处理对白蚁拒食作用差异不显著。由于对纤维素酶活性的抑制作用，使得其不能有效分解纤维素而缺乏营养，可能是造成白蚁死亡的主要原因。3种三萜类化合物对白蚁生物活性的其他机理还有待于进一步研究。

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收稿日期：2017-08-09

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303027）； 山东省农业科学院科技创新工程项目（CXGC2016B11）

作者简介：陈浩（1986—），男，山东乳山人，助理研究员，研究方向为农业害虫综合防治研究。E-mail： cha.active@163.com

通讯作者：于毅（1965—），男，山东宁津人，研究员，主要从事农业害虫防治研究。E-mail：robertyuyi@163.com

周仙红（1982—），女，山东威海人，助理研究员，研究方向为害虫综合防治研究。E-mail： zhouxianhong82@163.com