不可分型流感嗜血杆菌脂肽P4诱导气道上皮细胞分泌黏蛋白的机制

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(1.南华大学附属第一医院急诊科，衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院急诊科)

·基础医学·

不可分型流感嗜血杆菌脂肽P4诱导气道上皮细胞分泌黏蛋白的机制

王剑1，李旎2*，李晶2，周定耕2，王彪2

(1.南华大学附属第一医院急诊科，衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院急诊科)

目的研究不可分型流感嗜血杆菌脂肽P4诱导气道上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC的作用及机制。方法培养人气道上皮细胞NCI-H292，用不同浓度的P4孵育细胞，检测粘蛋白5AC(MUC5AC)的分泌及mRNA表达、ROS的产生及肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)的活性；分析Duox1 p47phox和P67phox亚基亚细胞转位和表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化。结果0、30、50和100 ng/mL P4作用NCI-H292细胞24 h后，可诱导其分泌MUC5AC并表达其mRNA，并促进p47phox和P67phox亚基转位至细胞膜、增高细胞内ROS的含量，同时可上调TACE的酶活性及诱导EGFR磷酸化。NADPH氧化酶抑制剂可抑制ROS产生；而ROS抑制剂处理则可降低TACE的酶活性；沉默TACE表达后可抑制EGFR磷酸化，而EGFR抑制剂处理可降低MUC5AC分泌。结论P4经Duox1/ROS/TACE/ EGFR诱导人NCI-H292细胞分泌MUC5AC。

不可分型流感嗜血杆菌； 脂肽P4； 表皮生长因子受体； 肿瘤坏死因子α转化酶； 粘蛋白5AC

不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus，NTHi)是定植于鼻咽和后口咽上呼吸道的一种无荚膜革兰阴性多形杆菌，当机体免疫力降低时，寄居于儿童鼻咽部的NTHi可通过咽鼓管到达中耳，导致急性中耳炎[1]。而成人则可引起慢性支气管炎以及COPD急性发作[2]。因此，开展NTHi的致病机制研究，对防治NTHi的相关疾病或并发症具有重要意义。NTHi缺乏荚膜，细菌的脂蛋白在NTHi的致病过程中发挥重要作用。P4蛋白是几乎存在于所有流感嗜血杆菌菌株中(含NTHi)高度保守的一种外膜蛋白。研究表明，P4蛋白锚定于外膜上，并在NTHi的致病过程中发挥重要作用[3]。NTHi感染后，最显著的特征是诱导呼吸道上皮细胞过度分泌黏液。在气道黏液中，黏蛋白5AC (MUC5AC)是主要的分泌型黏蛋白，由杯状细胞分泌，它主要存在于气道表面上皮细胞层，在器官与主支气管中表达较多，而在细支气管(<1mm)以及肺上皮细胞中无表达[4]。黏蛋白作为固有免疫系统的一道非特异性屏障，在维持气道功能等方面发挥重要作用[5]。但在某些病理条件，黏液的过度分泌可引起呼吸道管腔阻塞、引发严重的气流受限，从而导致呼吸道反复感染[6]。研究证实，NTHi感染机体后可上调气道上皮细胞分泌MUC5AC，从而参与与支气管哮喘和COPD急性发作。但这些研究多局限于以NTHi为整体作为研究对象，而对于NTHi菌体上的外膜蛋白在MUC5AC的分泌中发挥何种作用目前尚不明确。本研究旨在观察NTHi膜脂蛋白P4对MUC5AC分泌有无影响，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1主要实验材料NTHi脂肽P4购自德国Microcollections ，MUC5AC ELISA检测试剂盒购自R&D Systems。鼠抗人表皮生长因子受体(EGFR)抗体(磷酸化及非磷酸化)购自Cell signaling。Apocynin、AG1478购自Calbiochem。二亚苯基碘(DPI)、N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、2′,7′-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(H2DCFDA)以及肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)抑制剂TAPI购自Sigma-Adrich。TACE活性检测试剂盒购自Anaspec。鼠抗人p47phox及兔抗人p67phox抗体，鼠抗人β-actin抗体以及HRP标记兔抗鼠IgG抗体购自Santa Cruz，Duox1和TACE siRNA由广州RiboBio Co.Ltd合成。

1.2细胞培养人气道上皮细胞NCI-H292 (ATCC,Manassas,VA)采用含有10%胎牛血清，1%葡萄糖，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640基中，置于含5% CO2的恒温培养箱中37℃条件下培养。

1.3实时定量PCR 采用GE公司提供的试剂盒提取细胞总RNA(RNA Spin Mini RNAisolation kits，Buckkinghamshire，UK)，随后获取1μg RNA将其逆转录为cDNA。将cDNA、SYBR Green Master Mix、引物等反应体系置于实时定量PCR仪(Chromo4，Bio-Rad)上对基因进行扩增。扩增条件为：95 ℃ 5 min，随后进入40个循环：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。本文所用的引物为：5′-CCTTCGACGGACAGAGCTAC-3′(正向)和5′-TCTCGGTGACAACACGAAAG -3′(反向)；GAPDH：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′ (正向)和5′-GATCTCGCT CCTGGAAGATG-3′。根据靶基因与内参GAPDH的ΔCt值计算MUC5AC的相对表达倍数。

1.4 ELISA 细胞处理结束后，获取NCI-H292细胞测定其分泌至培养上清中的MUC5AC浓度，其检测方法按照试剂盒提供的双抗体夹心法进行，最后根据标准曲线计算MUC5AC的总量。

1.5 Western blot 按照参考文献提供的方法提取细胞膜蛋白[7]，即，将细胞重悬浮于含有蛋白酶抑制剂的relaxation buffer 中(100 mM KCl、3 mM NaCl、3.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、10 mM Hepes、0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)。经超声破碎后，4 ℃ 600×g 离心10 min以去除细胞核即未破碎细胞.获取上清液后4 ℃100,000×g超速离心30 min，继续用relaxation buffer 重悬浮沉淀并充分震荡后再次4 ℃100,000×g超速离心30 min，上清即为细胞膜成分。细胞总蛋白的提取按参考文献提供的方法进行[8]。所获取的膜蛋白或总蛋白通过测定其浓度后，获取50 μg蛋白在12%浓度的分离胶中进行SDS-PAGE，电泳结束后将其转印至硝酸纤维素膜上，并用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，最后分别加入相应一抗以及二抗，化学发光、显影(Amersham Bioscience，NJ，USA)。

1.6分子探针检测ROS产生NCI-H292细胞处理完毕后，PBS洗涤1次，随后加入H2DCFDA染液(5 μmol/L)室温下避光孵育30min，每隔10min轻微震荡1次，使探针和细胞充分作用。孵育结束后800 rpm离心洗涤3次以去除未结合的残余的探针。在荧光酶标仪(Synergy HT,Bio-Tec)下测定细胞内的荧光强度，并计算其荧光相对强度(激发波长485 nm，发射波长530 nm)。

1.7转染与RNA干扰将约105个NCI-H292细胞接种于6孔板中过夜培养。随后按照厂家提供的实验步骤加入终浓度为10nmol/L的Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) 试剂将siRNA转染至细胞中。本研究所用的siRNA按照参考文献提供的序列合成[7]，其中Duox1的干扰序列为：5′-GGACUUAUCCUGGCUAGAGTT-3′(正义链)和5′-CUCUAGCCAGGAUAAGUCCTG-3′(反义链)；TACE的干扰序列为：5′-GGUUUUAAAGGCUAUGGAATT-3′(正义链)和5′-UUCCAUAGCCUUUAAAACCTG-3′(反义链)。

1.8 TACE活性分析采用荧光共振能量转移法间接测定TACE的酶活性，其步骤按照试剂盒的方法进行。在该试剂盒中提供了一种底物QXLTM520/ 5-FAM，TACE能特异性切割该底物，从而使荧光分子5-FAM无法被QXLTM520淬灭，其荧光强度与TACE的活性成正比，通过测定器荧光强度间接测定TACE的活性(激发波长490nm，发射波长520nm)，结果以相对活性表示。

1.9统计学方法所有计量资料以均数±标准差表示，并使用GraphPad Prizm 6.0统计软件(San Diego,CA)分析数据，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 NTHi P4对NCI-H292细胞分泌表达MUC5AC的影响ELISA结果显示，阳性对照组采用5 ng/mL LPS处理后，MUC5AC分泌水平较高。而用不同浓度脂肽P4处理后，随着P4浓度的递增，MUC5AC分泌水平逐渐增多，当P4浓度为100 ng/mL时，MUC5AC高达(439.65±18.57)ng/mL(图1A)。实时定量PCR也显示：不同浓度的P4脂肽处理细胞后，对MUC5AC mRNA的诱导情况有所不同，随着P4浓度的递增，MUC5AC mRNA的表达水平逐渐增多(图1B)。

图1 不同浓度P4诱导NCI-H292细胞表达分泌MUC5AC的影响A：细胞分泌MUC5AC蛋白；B：细胞表达mRNA。与阴性对照组(0 ng/mL)相比，*P<0.05，**:P<0.01。

2.2 Duox1/ROS参与MUC5AC分泌图2A所示，30～50 ng/mL P4处理后可显著诱导提高细胞内ROS水平(图2A)，也可明显促进NOX酶体(催化ROS产生的关键酶)的p47phox和p67phox亚基从细胞浆转位至细胞膜(图2B)，表明P4可激活NOX。而采用1mmol/L NOX抑制剂(抑制NOX酶体组装)Apocynin处理后，可显著抑制p47phox和p67phox的转位以及ROS的产生(图2A、B)。而采用siRNA干扰Duox1(NOX亚型)表达后，NCI-H292细胞中ROS的水平明显减少(图2C)，同时伴有MUC5AC的降低(图2D)，表明P4诱导ROS产生以及MUC5AC分泌与激活NOX家族中Duox1有关。此外，采用ROS抑制剂NAC预处理细胞后，发现MUC5AC的分泌显著降低(图2E)，表明MUC5AC分泌受ROS调控。

2.3 P4经ROS增强TACE活性用不同浓度P4处理NCI-H292细胞30 min后，结果显示，随着P4浓度的递增，TACE的酶活性逐渐增高，当P4浓度为100 ng/mL时，TACE的酶活性增加了2.51倍(图3A)。而采用siRNA干扰Duox1表达后，TACE的酶活性明显降低(图3B)。此外，采用不同浓度ROS抑制剂NAC预处后也得到了类似的结果(图3C)。而采用TACE siRNA处理后，可明显抑制P4诱导MUC5AC的分泌(图3D)。

图2 Duox1/ROS通路在介导MUC5AC分泌中的影响A：Apocynin对P4处理后ROS含量的影响。与0 ng/mL P4组相比，*:P<0.05，与100 ng/mL P4组相比，#:P<0.05；B：P4对NCI-H292细胞膜上p47phox和P67phox表达的影响，同时采用Gα蛋白(Gαs)作为内参；C：干扰Duox1表达后对ROS或MUC5AC分泌的影响，与对照siRNA(scrambled siRNA,scrb)组相比，*:P<0.05，**:P<0.01；Duoxi siRNA(D)或ROS抑制剂NAC(E)对MUC5AC分泌的影响。与0 ng/mL P4组相比，**:P<0.01，与100 ng/mL P4组相比，#:P<0.05。

图3 P4经ROS/TACE诱导MUC5AC分泌A：不同浓度P4对细胞上清中TACE酶活性的影响。与阴性对照组(0 ng/mL)相比，*:P<0.05；B：NCI-H292细胞转染Duox1 siRNA后对TACE酶活性变化的影响。与scrb组相比，*:P<0.05，与100 ng/mL P4+scrb组相比，#:P<0.05；C：不同浓度ROS抑制剂NAC对TACE的酶活性的影响，与阴性对照组(0 ng/mL)相比，*:P<0.05；与100 ng/mL P4组相比，#:P<0.05。D：转染TACE siRNA后对TACE酶活性变化的影响。与scrb组相比，**:P<0.01，与100 ng/mL P4+scrb组相比，#:P<0.05。

2.4 P4诱导MUC5AC分泌与EGFR激活有关不同浓度P4刺激鼻黏膜细胞0～1 h，细胞内磷酸化EGFR含量显著增多，30～60 min后达到峰值。而采用10 μmol/L TACE抑制剂TAPI处理后，EGFR磷酸化水平明显受到抑制(图4A)，而采用5 μg/mL EGFR中和抗体预处理细胞30 min后，结果发现可显著下调MUC5AC的水平(图4B)，此外，EGFR 抑制剂AG-1478处理(10 μmol/L)也得到了类似结果(图4C)，以上结果表明EGFR的激活与MUC5AC分泌有关。

图4 P4诱导MUC5AC分泌与EGFR激活有关A：P4刺激对EGFR的磷酸化的影响；B：EGFR中和抗体对细胞上清中MUC5AC含量的影响。与0 ng/mL P4组相比，**:P<0.01，与100 ng/mL P4组相比，#:P<0.05。C：EGFR抑制剂AG-1478对MUC5AC分泌的影响。与0 ng/mL P4组相比，**:P<0.01，与100 ng/mL P4组相比，#:P<0.05。

3 讨 论

研究NTHi与宿主免疫系统相互作用，直接采用活菌感染细胞或提取其细胞膜成分作用于细胞更真实接近体内的实际情况，而本研究采用P4脂肽代替，其主要原因有两方面：第一，NTHi在细胞培养基内生长速度和细胞生长速度不一致，难以控制感染复数。第二，提取细胞膜成分时，涉及到NTHi的培养和去垢剂使用等多个环节，大大增加了内毒素污染的几率[9]。而气道上皮细胞本身对内毒素非常敏感，一旦膜脂蛋白中混有内毒素，很难用常规手段去除[9]。由于细菌膜脂蛋白发挥免疫刺激活性主要取决于其N末端的Pam3-Cys结构而非氨基酸序列，而基于其N端通用结构人工合成的P4具有几乎所有膜脂蛋白的致炎活性[10]，因此可作为NTHi膜脂蛋白的替代品而被本研究所采用。

调控MUC5AC分泌的分子众多，但不同的刺激因素所激活的信号通路有所不同。EGFR是一种跨膜型酪氨酸激酶，分子量170 KD。其胞外区可与多种配体结合，随后可由单体转化为二聚体，其胞内区具有激酶活性，可诱导下游多种底物磷酸化。本研究也证实，NCI-H292细胞在静息状态下，EGFR磷酸化水平极低，而给予100 ng/mL P4作用30 min后即可诱导EGFR磷酸化，并持续至2h以上。随后采用EGFR激酶抑制剂AG1478处理，或者采用EGFR特异性中和抗体封闭其受体表位后，MUC5AC的产生均受到明显抑制。这说明EGFR信号通路参与了P4作用后MUC5AC的表达，且该过程依赖于配体和EGFR的结合。

EGFR与相应的配体(如TGF-α)结合后，可活化其胞内区域促进MUC5AC分泌。研究表明，香烟提取物、革兰阴性细菌的LPS都是通过这种机制激活EGFR诱导黏蛋白MUC5AC表达上调[11]。EGFR常见的配体分子包括双向调节蛋白、表皮调节素、肝素结合生长因子和TGF-α等。在这一过程中，TACE发挥了关键作用。TACE属于金属水解蛋白家族的膜结合型整合素样金属蛋白酶，它可促进前体TGF-α分子的成熟，后者随后可与EGFR通过配体—受体相互作用而诱导EGFR磷酸化[12]。本研究当中，我们也发现P4作用NCI-H292细胞30min后即可增高TACE的酶活性，而采用TACE siRNA处理后，可明显抑制P4诱导MUC5AC的分泌，此外，TACE抑制剂TAPI处理后也能抑制EGFR的磷酸化，这表明P4通过TACE/EGFR促进MUC5AC的分泌。

本研究证实，P4处理后30min后，即可显著上调细胞内ROS的水平，采用ROS抑制剂处理后，TACE活性明显降低，这表明TACE上游的激活有赖于ROS的产生。而ROS的产生又受NOX家族蛋白Duox的调控。Duox由一个膜结合细胞色素b558，gp91phox和p22phox以及4个胞浆成分p47phox，p67phox，p40phox和Rac1/2组成，其中gp91phox是其催化核心部分，有研究表明，Duox1在LPS诱导的MUC5AC分泌中发挥重要作用[13]。本研究也发现，P4处理NCI-H292细胞后可促进Duox1的装配，即p47phox和p67phox转位至细胞膜上，从与gp91phox等而形成具有催化功能的酶复合体。而采用siRNA沉默其表达，或采用抑制NOX酶体组装的抑制剂Apocynin处理后，ROS的分泌以及MUC5AC的产生明显减少，以上结果表明P4诱导MUC5AC的分泌受Duox1/ROS/TACE通路的调控。

总之，本研究证实P4可诱导气道上皮细胞分泌MUC5AC。这表明NTHi感染后，可能通过促进MUC5AC的过度分泌而加重某些阻塞性疾病的病情。若气道内炎症状态持续存在，黏液合成进一步增多，随后又有利于病原菌定植，从而形成恶性循环，加速病情恶化[14]。既然P4脂肽在NTHi中发挥重要作用，同时P4也具备了良好的免疫原性与抗原性，并且在疫苗的研制当中体现出了良好的效果[15]，从这种意义上讲，以P4为分子靶标的药物开发，有望为NTHi感染后的防控提供新的思路。

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NontypeableHaemophiluslipopeptideP4inducesthesecretionofMUC5ACinairwayepithelialcells

WANG Jian,LI Ni,LI Jing,et al

(DepartmentofEmergencySurgery,TheFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang421001,HunanChina)

ObjectiveTo underly the mechanism of the effect ofNontypeableHaemophiluslipopeptideP4 on the secretion of MUC5AC in airway epithelial cells.MethodsHuman airway epithelial cell line NCI-H292 was incubated with different concentration of P4.The concentrations of secreted MUC5AC and the expression of MUC5AC mRNA,the production of reactive oxygen species (ROS) and the enzymatic activity of tumor necrosis factor-α converting enzyme (TACE) were tested.The cell membrane localization of p47phoxand P67phoxsubunits of Duox1 and the phosphorylation of epidermal growth factor receptor (EGFR) were anylized.Results30,50 and 100 ng/mL of P4 increased the expression and secretion of MUC5AC after 24 h of incubation In addition,P4 could induce the p47phox和P67phoxtranslocation from cytosol to plasma membrane and upregulate the intracellular ROS lever.Moreover,P4 could also promote the enzymatic activity of TACE and phosphorylation of EGFR.Pretreatment of the NADPH oxidase inhibitor significantly abrogated the ROS level,and ROS inhibitor could further decrease the enzymic activity of TACE,while silence of TACE could inhibit P4-induced EGFR phosphorylation.Furthermore,the EGFR inhibitor treatment could decrese the MUC5AC secretion.ConclusionP4 induces the expression and secretion of MUC5AC via Duox1/ROS/TACE/ EGFR signaling pathway in NCI-H292 cells.

nontypeable haemophilus; P4; epithelial growth factor receptor; tumor necrosis factor-α converting enzyme; MUC5AC

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.003

2017-03-23；

2017-06-12

国家自然科学基金(编号：31500156)；湖南省卫生厅科研基金(B2014-054).

*通讯作者，E-mail:lini1283@163.com.

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