基于Plackett–Burma的湖南芥菜发酵菌种高密度培养条件优化

侯爱香，王一淇，姜辉，郑旭，李宗军



基于Plackett–Burma的湖南芥菜发酵菌种高密度培养条件优化

侯爱香，王一淇，姜辉，郑旭，李宗军*

(湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410028)

为实现湖南芥菜发酵菌种的高密度培养，以感官评分和亚硝酸盐含量为评价指标，从自然发酵湖南芥菜中筛选出合适作芥菜发酵剂的LA与R6组合混合菌种和R2单一菌种。采用Plackett–Burma从11种营养物质中筛选出葡萄糖、硫酸铵、胰蛋白胨、牛肉膏为LA与R6混合菌种的主要增殖物质；乳清粉、硫酸铵、胰蛋白胨、酵母浸出粉为R2菌种的主要增殖物质。通过布列可特—博曼(Plackett–Burma)设计方法和正交试验，得出LA与R6混合菌种培养基最优配方是葡萄糖3%、牛肉膏1.5%、硫酸铵0.5%、胰蛋白胨1%，pH 6.0，在此优化条件下，以3%的接种量，于33 ℃培养发酵21 h，菌落总数达3.62×1010cfu/mL。R2菌种最优培养基配方为乳清粉4%，硫酸铵1.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母浸出粉2%，pH 6.0，在此优化培养条件下，以3%接种量于29 ℃培养发酵21 h，菌落总数达1.85×1012cfu/mL。

芥菜；发酵；高密度培养；乳酸菌；布列可特—博曼设计方法

优良的发酵剂是实现发酵食品优良品质的重要保证，发酵菌种的高密度培养技术是制备优良发酵剂的基础[1]。传统的湖南发酵芥菜是由芥菜自然发酵而成的一种传统健康发酵食品，不仅具有营养和保健功效[2–3]，而且具有脆嫩芳香、清爽可口、回味悠久、解腻开胃等特点[4]，深受大众喜爱。目前，湖南发酵芥菜是方便面、方便米粉等快餐方便食品酱料包的重要组分，市场需求量大，但芥菜供应具有周期季节性限制，传统自然发酵不易控制因素多，发酵过程中杂菌容易繁殖，且传统高盐工艺还具有亚硝酸盐污染和危害等，所以，发酵芥菜的风味品质难以保证。湖南发酵芥菜常用的发酵微生物是乳酸菌。乳酸菌具有许多益生功能[5]，实现乳酸菌的高密度培养是缩短湖南芥菜发酵生产时间、保证产品质量和食品安全性、减少甚至防止亚硝酸盐产生的有效途径。Plackett– Burma设计法适合从许多考虑因素中快速地筛选出最为重要的因素[6–8]，是进行高密度培养条件优化的有效方法。笔者按照湖南芥菜自然发酵过程中菌相变化的规律，在湖南自然发酵芥菜中筛出适合芥菜发酵的优势菌——植物乳杆菌() LA、戊糖片球菌(s) R6 和肠系膜明串珠菌() R2，并将筛得菌种的单个或组合进行人工接种，发酵芥菜，选出芥菜感官评分高的组合发酵菌种或单一发酵菌种。采用Plackett–Burma试验设计，结合正交试验，从培养基组成成分和培养条件两方面进行优化，旨在实现湖南芥菜菌种的高密度培养，为实现发酵芥菜的工业化生产提供参考依据。

1　材料和方法

1.1　材料

植物乳杆菌() LA、戊糖片球菌() R6 和肠系膜明串珠菌() R2，均由湖南农业大学食品科学技术学院实验室从湖南省华容县芥菜基地的发酵芥菜中筛选得到；鲜芥菜由湖南省华容县芥菜基地提供；番茄汁由湖南农业大学食品科学技术学院实验室制得。

蔗糖、乳糖、乳清粉(乳糖70%，蛋白质 11%)、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸铵、胰蛋白胨均为分析纯。

MRS培养基[9]组分：蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母提取物 5 g，K2HPO42 g，柠檬酸二铵 2 g，乙酸钠 5 g，葡萄糖 20 g，吐温–80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4∙4H2O 0.25 g，蒸馏水1 L。MRS培养基pH为6.2~6.4，121 ℃灭菌20 min。

主要仪器：超净工作台(安徽蚌埠市瑞风净化设备工程)；电热恒温培养箱(上海新苗医疗器械执照有限公司)；恒温干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)；紫外分光光度计UV－2550 (日本岛津)；电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司) 。

1.2　方法

1.2.1人工接种发酵芥菜的制备

人工接种发酵芥菜参照文献[10]进行制备：芥菜切块后称取质量，装坛，压实，倒入质量分数6%的食盐，按蔬菜质量的0.04%加入发酵菌种，盖盖，加水密封，25 ℃控温发酵60 d。按照此工艺流程，将自然发酵制备的芥菜命名为Z。按以下菌种组合制作出的7个发酵芥菜产品命名如表1。以发酵芥菜产品感官评价得分和亚硝酸盐含量为指标，筛选合适的发酵菌种。

表1　人工接种发酵芥菜的命名

1.2.2生长曲线的确定

将2%的菌种接种于液体MRS培养基中，37 ℃培养24 h，每隔3 h测定发酵液的650 nm值，确定其生长稳定期时间[11–12]。以空白培养基为对照。

1.2.3Plackett–Burma试验设计

Plackett–Burma试验流程[13–18]：菌种活化，混合，将2%接种量MRS培养基于37 ℃培养18 h，将2%接种量基础培养基于37 ℃培养48 h(培养基不同成分选择)，收集菌体，烘干，称取其质量。此阶段试验研究选取的影响因素见表2，评价指标为菌体干质量。本试验的设计需要用的软件为Design–Expert (Version 7.0，Stat–Ease Inc，M inneapolis，M N. USA)和Minitab 16。

表2　Plackett–Burman试验因素的编码水平

1.2.4菌体高密度培养的培养基组成成分优化和培养条件优化

采用次数=11的Plackett–Burma试验设计，对蔗糖、乳糖、乳清粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸铵、胰蛋白胨影响LA+6 混合菌和R2单一菌的11个因素进行研究。按表2进行试验，培养48 h后收集菌体，干燥，称取质量。

采用Plackett–Burman 试验设计，以MRS培养基配方为原型，把原有的碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物)剔除，从碳源(葡萄糖、蔗糖、乳清粉、乳糖)中选出1种，从氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸铵、胰蛋白胨)和促进因子(如番茄汁)中选出3种对发酵菌种增殖最明显的因子。

根据Plackett–Burman 试验设计结果，选碳源(X1)、氮源(X2、X3)和促进因子(X4)为考察因素，设4个水平，采用16(44)正交试验设计，以菌体干质量为评价指标优化培养基成分。

在培养基优化结果的基础上，选起始pH 值、培养温度、接种量和培养时间为考察因素，设4个水平，采用16(44)正交试验设计，以菌液650 nm为评价指标优化菌种的培养条件。

1.2.5发酵芥菜的感官评价与发酵芥菜亚硝酸盐含量测定

芥菜发酵60 d后，按照文献[17]、文献[18]中的方法，由10名专业食品化验员针对样品的色泽形态、香气、滋味、质地进行评分，评分标准和权重参考表3，统计各评审化验员评分的平均值。

参照文献[10]的方法，分别测定不同发酵芥菜产品的亚硝酸盐含量。

表3　发酵芥菜感官评分的标准

2　结果与分析

2.1　发酵芥菜的感官评分和亚硝酸盐含量

由表4可见，7组人工接种发酵芥菜的亚硝酸盐含量都远远低于自然发酵产品，7组产品之间亚硝酸盐含量的差异不明显，说明筛选出来的3个发酵菌株都能一定程度上降低芥菜中的亚硝酸盐含量，其组合或单独发酵对亚硝酸盐含量的影响不明显。发酵芥菜产品A+6和R2的得分明显高于其他组，说明这2组产品的发酵菌种植物乳杆菌LA和戊糖片球菌R6组合菌，以及肠系膜明串珠菌R2适合用于发酵芥菜，因此，选用这2个产品的发酵菌种进一步进行高密度培养，以获得优质的直投式芥菜发酵剂。

表4　不同发酵芥菜的感官评分及亚硝酸盐含量

2.2　A+6与R2产品发酵菌种的生长曲线

由图1可知，A+6发酵菌种植物乳杆菌LA和戊糖片球菌R6组合菌发酵0~3 h处于迟缓期，发酵3~18 h处于对数期，在发酵18 h时，发酵液的值达最大值；发酵时间超过18 h时，值趋于平缓，表明该混合菌此时处于稳定期。R2产品发酵菌种肠系膜明串珠菌R2在发酵0~3 h处于迟缓期，发酵3~12 h处于对数期，发酵12 h时，其发酵液的值达最大值，发酵超过12 h趋于平缓，表明该菌进入了稳定期。

图1　A+6与R2产品发酵菌种的生长曲线

2.3　培养基优化结果

2.3.1A+6混合菌培养基优化结果

由表5和表6可知，成分a、d、e、f、h、i、j、k表现为正效应，成分b、c、g表现为负效应。由效应大小可看出，对A+6混合菌增值产生主要正效应的为d、f、i、j，且效应显著，因此，A+6混合菌的培养基成分宜选葡萄糖、牛肉膏、硫酸铵和胰蛋白胨。

表5　A+6和R2的Plackett–Burma 试验结果(n=11)

表6　A+6和R2各因素的效应值及显著性分析(n=11)

2.3.2R2菌培养基的优化结果

由表5和表6可知，成分c、d、e、g、h、i、j、k表现为正效应，成分a、b、f、h表现为负效应。由效应大小可看出，对R2菌增值产生主要正效应的为c、f、g、j，且效应显著，因此，R2菌的培养基成分宜选用乳清粉、硫酸铵、胰蛋白胨、酵母浸出粉。

2.4　培养基的正交试验优化结果

2.4.1A+6混合菌培养基的优化结果

表7中的极差A>C>B>D>E，表明对A+6混合菌增值的影响从大到小依次为A、C、B、D、E(空白)，A+6混合菌培养基成分的最佳组合为A3B3C1D2，即葡萄糖3%，牛肉膏1.5%，硫酸铵0.5%，胰蛋白胨1%。

表7　A+6培养基优化的正交试验结果

2.4.2R2单一菌培养基的优化结果

表8中的极差A>C>E>D>RB，表明对R2混合菌增值的影响从大到小依次为A、C、E、D、B(空白)，R2单一菌培养基成分最佳组合为A4C3D1E4，即最佳组合为乳清粉4%、硫酸铵1.5%、胰蛋白胨0.5%、酵母浸出粉2%。

表8　R2培养基优化的正交试验结果

2.5　培养条件优化的正交试验结果

2.5.1A+6混合菌培养条件的优化结果

表9中极差C>D>A>B>E，对A+6混合菌增值的影响从大到小依次为C、D、A、B、E(空白)，在正交试验中得到A+6混合菌培养条件优化的最优组合为A2B2C2D4，即pH 6.0，接种量3%，在33 ℃的条件下发酵21 h。对最佳组合条件下进行验证，得到650 nm为0.621，菌落总数为3.62×1010cfu/mL，达高密度培养效果，因此，认为在pH 6.0、接种量3%、33 ℃的条件下发酵21 h为A+6混合菌的最佳发酵条件。

表9　A+6培养条件的正交试验结果

2.5.2R2菌种培养条件的优化结果

R2培养条件的正交试验结果(表10)表明，极差D>B>A>C>E，对R2菌增值的影响从大到小依次为D、B、A、C、E(空白)，R2菌培养条件的优化最优组合为A2B2C1D4，即pH 6.0，接种量3%，在29 ℃的条件下发酵21 h，此时650 nm为1.904 0，菌落数为1.85×1012cfu/mL，达高密度培养效果。

表10　R2培养条件的正交试验结果

表10(续)

4　结论与讨论

采用Plackett–Burma设计法，从11种营养物质中筛选出了A+6混合菌的主要增殖物质为葡萄糖、硫酸铵、胰蛋白胨和牛肉膏；R2菌的主要增殖物质为乳清粉、硫酸铵、胰蛋白胨和酵母浸出粉。

采用Plackett–Burma试验设计和正交试验，得出LA+6混合菌种培养基的最优配方为葡萄糖3%、牛肉膏1.5%、硫酸铵0.5%、胰蛋白胨1%，pH 6.0。在此优化条件下，当接种量为3%、培养温度为33 ℃、发酵21 h时，菌落总数达3.62×1010cfu/mL。

采用Plackett–Burma试验设计和正交试验，得出R2菌种最优培养基配方为乳清粉4%，硫酸铵1.5% ，胰蛋白胨0.5%，酵母浸出粉2%，pH 6.0。在此优化培养条件下，当接种量为3%、培养温度为29 ℃、发酵时间为21 h时，菌落总数达1.85×1012cfu/mL。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王库

Optimizing the high–density culture conditions for bacteria fermentation of chinese leaf mustard based on Plackett–Burman

HOU Aixiang, WANG Yiqi, JIANG Hui, ZHENG Xu, LI Zongjun*

(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410028, China)

In order to obtain high–density cultivation condition for the fermentation of Hunan brassica juncea, mixed strains of LA and R6, and single strain R2 which were suitable for the mustard starter culture, were screened out in the natural fermentation process based on indicators of sensory evaluation and nitrite content. 11 kinds of nutrients including glucose, ammonium sulfate, tryptone and beef extract were screened out as the main proliferation substances for mixed strains of LA and R6 according the result of Plackett–Burma design method; while whey powder, ammonium sulfate, tryptone and yeast extract powder were screened out for those of strain R2. The results showed that the optimum formula for mixed culture medium of LA and R6 was consisted of 3% glucose, 1.5% beef extract, 0.5% ammonium sulfate, and 1% tryptone in pH 6.0. The total number of colonies could reach to 3.62×1010cfu/mL in the formula with conditions of 3% inoculation, 33 ℃ culture temperature, and 21 h fermentation. For strain R2, the optimum culture medium was consisted of 4% whey powder, 1.5% ammonium sulfate, 0.5% tryptone, and 2% yeast extract in pH 6.0. The total number of colonies in the formula could reach to 1.85×1012cfu/mL at the temperature of 29 ℃ for 21 h of fermentation.

mustard; fermentation; high density culture; lactic acid bacteria; Plackett–Burma design method

TS252.53

A

1007-1032(2017)06-0669-07

2017–06–21

2017–11–15

湘潭市科技计划重点项目(NY–ZD20161003)

侯爱香( 1982—)，女，湖南临湘人，博士研究生，讲师，主要从事食品微生物技术和食品文化研究，aixianghou@163.com；

通信作者，李宗军，教授，主要从事食品生物技术研究，hnlizongjun@163.com

投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn