脑血疏对大鼠脑出血的行为学及凝血功能的影响

张 营 刘 涛 于 荣 周 明 闫 峰 罗玉敏*

(1.潍坊市中医院脑病重症急救科，山东潍坊 261042;2.首都医科大学宣武医院脑血管病研究室，北京 100053)

·神经系统疾病的基础和临床研究·

脑血疏对大鼠脑出血的行为学及凝血功能的影响

张 营1, 2刘 涛1于 荣1周 明1闫 峰2罗玉敏2*

(1.潍坊市中医院脑病重症急救科，山东潍坊 261042;2.首都医科大学宣武医院脑血管病研究室，北京 100053)

目的研究脑血疏对大鼠脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)的行为学及凝血功能的影响。方法21只大鼠通过注射Ⅳ型胶原酶建立ICH模型，采用数字表法随机分为：对照组、A组和B组，A、B组分别给予高浓度和低浓度脑血疏，神经功能评分采用Longa评分法、前肢踩空试验和12分评分法3种方法分别在脑出血后24、48、72 h进行神经功能评分和称体质量，72 h后采血进行凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)、凝血酶时间(thrombin time，TT)、国际标准化比值(International Normalized Ratio，INR)检测。结果体质量比较显示：A组和B组的24 h与72 h体质量比较差异有统计学意义(P<0.05)，B组和对照组的72 h体质量比较差异有统计学意义(P<0.05)；Longa评分结果显示：B组的24、48和72 h Longa评分差异有统计学意义(P<0.05)；凝血四项指标结果显示：B组和对照组的PT差异有统计学意义(P<0.05)，A组和对照组的APTT差异有统计学意义(P<0.05)，B组和对照组的APTT差异有统计学意义(P<0.05)，B组和对照组的INR差异有统计学意义(P<0.05)。结论脑血疏可以改善脑出血急性期大鼠体质量下降以及神经功能评分，机制与其影响凝血功能有关。

脑血疏；脑出血；神经功能评分；凝血功能

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是临床常见急症，具有起病急、病情重、预后不良的特点。该病好发于中老年人，突发起病，临床表现为偏瘫、失语，甚至很快出现意识障碍，占急性脑卒中的9%～27%，是危害最严重的脑卒中类型，发病1年后病死率高达54%[1]。积极有效的治疗方案一直是医学基础研究和临床探讨的热点。中医对出血性卒中的认识为“瘀血阻滞，脉道不利”，血溢脑脉之外造成瘀血停滞、脑髓受压，血行不畅，损伤脑髓。中医认为瘀血既为脑出血之病理基础，又为脑出血之病理产物，是为离经之血即为瘀，因此脑出血急性期给予活血化瘀治疗取得了良好的临床效果[2]。脑血疏主要成分是黄芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黄、川芎，具有益气活血的功效，用于脑出血的治疗，可以增加脑血流、改善微循环、促进血肿的吸收。本项研究观察了早期应用脑血疏对脑出血大鼠的体质量及神经功能的影响，并对其神经保护机制进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1)实验动物：SD雄性大鼠21只，体质量280～310 g，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2008-0001。术前禁食，但自由进水12 h。

2)实验仪器：小动物呼吸机(Harvard Apparatus 683，美国)、双极电凝(德威，ACC100，北京天业爱博科贸有限公司)、显微镜(Carl Zeiss公司，美国)、反馈式温度调节仪(Harvard Apparatus公司，美国)、血气分析仪(Abbott，i-STAT公司，美国)、有创血压监测仪(Biopac公司，DA100C，美国)、牙科钻(Saeshin Strong207，韩国)，精密电子天平(Adventurer，上海艾测电子科技有限公司)、大鼠手术操作台、显微手术器械。

3)实验试剂：0.9%(质量分数)NaCl注射液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、多聚甲醛、恩氟烷 (河北九派制药)、10%(质量分数)水合氯醛(华瑞制药)、Ⅳ型胶原酶、脑血疏(沃华医药)。

1.2 实验方法

1)大鼠ICH模型：大鼠称体质量后，在4%～5%(体积分数)恩氟烷、30%(体积分数)O2/70%(体积分数)N2O下诱导麻醉。约5 min后将其尾部抬起无任何张力且随重力自然落下表示诱导麻醉成功。将大鼠固定于操作台上，手术显微镜放大倍数调节至16倍，进行气管插管。插管成功后迅速连接动物呼吸机，在1%～2%(体积分数)恩氟烷、30%(体积分数)O2/70%(体积分数)N2O下维持麻醉。俯卧位固定于动物头颅立体定向仪上，头皮纵向剪开，取前囟为原点，向右3 mm，向后1 mm，深度5 mm为注射点(尾状核)，磨钻磨开颅骨，进针后缓慢注射0.2U Ⅳ型胶原酶溶于1 mL的0.9%(质量分数)氯化钠注射液，留针10 min缓慢退针，骨蜡封闭钻孔，缝合头皮[3]。

2)动物分组：21只大鼠采用数字表法随机分为3组(每组7只)，A组：高剂量组；B组：低剂量组；C组：对照组。实验组给予脑血疏口服液灌胃，其成分包括黄芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黄、川芎，其中高剂量组比低剂量组的浓度高20倍，低剂量组的浓度是人的用量的10倍，均给予大鼠1.5 mL 每天2次灌胃。对照组给予蒸馏水1.5 mL 每天2次灌胃。均在脑出血模型建立后大鼠苏醒即刻及24 h和48 h后连续3 d灌胃[4]。

3)动物称体质量：入组21只大鼠分别在术前及术后24、48、72 h称体质量。

4)神经功能评分：(1)Longa 评分法[5]：评分标准采用Longa等推荐的5分法，并稍作改变，对大鼠神经功能进行评分：0分：正常；1分：脑缺血对侧的前肢不能伸展；2分：脑缺血对侧的前肢屈曲；3分：实验动物向缺血对侧轻度转圈；4分：实验动物明显向缺血对侧转圈；5分：实验动物爬行时倒向缺血对侧。(2)前肢踩空试验[6]：主要检测实验动物的视觉、触觉以及前肢对感觉及运动的整合能力。整个空格的面积为10×110 cm2，由许多正方形小网格组成(面积9 cm2)，小网格网丝的直径为1.0 mm，放置在离地面1米的高度。在实验中，让大鼠在1 min内，由空格的一端爬向另一端。如果爬行中，动物的前肢掉入网格里，记为一次前肢踩空，主要是因为脑组织缺血损伤导致运动功能失调。总共计数1 min内实验动物脑缺血对侧前肢出现的踩空错误数。(3)Belayev等[7]的12分评分法：①姿势反射测验，即提尾悬空试验：无明显神经功能缺失为0分，梗死对侧肢体屈曲为1分，侧推试验阳性为2分。②肢体放置试验：ⓐ视觉亚实验，即前方刺激——实验者将动物握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10 cm处向桌面缓慢斜线靠近(此时桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反应为前肢即刻抓向桌面，损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。0分：动物肢体放置反应正常；1分：反应延迟但不超过2 s；2分：反应延迟且超过2s。侧方刺激，此时桌子位于动物侧方，其余实验方法及评分标准同前方刺激。ⓑ触觉亚实验，将动物双眼遮住，并使其前爪悬空，此时大鼠应该既看不见，也不能用胡须触及桌面，用其前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅达皮肤和毛发，动物反应及评分同视觉亚实验，触觉刺激同样分前方及侧方刺激。ⓒ本体觉亚实验，操作及评分同触觉亚实验，仅刺激深度不同，本体觉亚实验给予前爪较大压力，刺激深达肌肉及关节。该亚实验只有前方刺激。动物前肢放置实验总分范围为0～10分，功能损伤越重，得分越高。

5)凝血四项指标检测:各组大鼠分别在脑出血后72 h，10%(质量分数)水合氯醛腹腔麻醉，心脏取血后送检，化验凝血四项指标，凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、纤维蛋白原时间(fibrinogen，Fib)、凝血酶时间(thrombin time，TT)、国际标准化比值(International Normalized Ratio，INR)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 脑血疏对脑出血大鼠体质量的影响

各组大鼠在术后24 h体质量均有下降趋势。同实验组不同时间点比较：高剂量组与低剂量组的72 h体质量均较24 h增加，差异有统计学意义(P<0.05)。同时间点不同实验组比较：72 h 低剂量组的大鼠体质量较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 体质量测量结果Fig.1 The results of the weight

*P<0.05vsgroup A in 24 h;ΔP<0.05vsgroup B in 24 h;▲P<0.05 Bvsgroup C in 72 h;C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

2.2 脑血疏对脑出血大鼠神经功能的影响

各组大鼠分别在脑出血术后24、48、72 h进行神经功能评分。结果显示，各组大鼠术后均出现神经功能缺陷症状，大多数表现为不同程度前肢屈曲，行走路径向左侧偏斜。

2.2.1 Longa法评分结果

同时间点不同组间大鼠Longa评分比较，差异无统计学意义。不同时间点同组间比较，低剂量组的48 h和72 h评分均低于24 h(P<0.05)，见图2。

图2 Longa评分结果Fig.2 Results of Longa Scores

*P<0.05vsgroup B in 24 h;C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

2.2.2 前肢踩空试验评分结果

不同时间点同组间比较以及同时间点不同组间比较，差异无统计学意义(图3)。

图3 前肢踩空试验评分结果Fig.3 Scores of the forelimb test

C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

2.2.3 Belayev 12分评分结果

不同时间点同组间比较，随着时间的增加，Belayev 12分评分结果有降低趋势，差异无统计学意义；同时间点不同组间比较，实验组较对照组有降低趋势，差异无统计学意义(图4)。

2.3 凝血四项结果

实验组PT与对照组比较均有降低趋势，其中低剂量组与对照组比较下降，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组APTT较对照组比较均有降低，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组Fib、TT与对照组比较均有降低趋势，但差异无统计学意义；实验组INR较对照组比较均有降低趋势，其中低剂量组与对照组比较下降，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

图4 Belayev 12分评分结果Fig.4 Results of the Belayev 12 scores

C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

图5 凝血指标变化Fig.5 Results of the coagulation

PT：prothrombin time；APTT：activated partial thromboplastin time；Fib:fibrinogen;TT:thrombin time;INR:International Normalized Ratio;*P<0.05vsgroup C;C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=6 in group C,n=7 in group A,n=5 in group B.

3 讨论

高血压性脑出血是脑出血中最常见的类型，其病理基础是长期高血压使细小动脉玻璃样变性和纤维素性坏死，血管顺应性降低、强度减弱，血压骤然升高时血管易破裂出血。血肿的占位效应可直接压迫邻近的脑组织导致神经功能缺损，如偏瘫、失语、感觉障碍、意识障碍等；脑出血后血肿的压迫效应诱发了血肿周围缺血区的形成。同时，血肿及其分解代谢产物的神经毒性作用又导致脑损伤的进一步加重，如破坏血-脑脊液屏障、参与炎性反应、诱导细胞凋亡、导致脑血管痉挛、诱发癫痫[8]。研究[9]显示，脑出血后神经功能恶化的主要原因是血凝块所释放的凝血酶是引起脑出血后脑水肿的关键因素，凝血酶是脑出血后病理生理变化的重要物质[10-11]。

凝血酶原时间(PT)测定是检测外源性凝血途径，用于检测外源性凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和相关因子的抑制物实验[12]；活化部分凝血活酶时间(APTT)测定反映了Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等内源性凝血途径因子的活性，是内源性凝血途径常用的筛选方法；纤维蛋白原(Fib)由α、β、γ三条多肽链以二硫键相连组成，在凝血酶的作用下α、β链释放出两条多肽生成纤维蛋白单体，单体聚合形成纤维蛋白多聚体，在钙离子和活化的Ⅷ因子的作用下单体以共价键相连形成稳定的不溶性纤维蛋白凝块[13]。凝血酶时间(TT)是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统的实验。

中医研究[14]显示，活血化瘀可以降低颅内压、促进血肿吸收，可以改善微循环，使侧支循环开放，毛细血管增生，出血部位周围的血管压力下降，有利于防止再出血。黄芪是脑血疏的主要成分，具有抗脂质氧化和消除自由基的作用，并能够增强纤维蛋白溶解活性[14]。水蛭是活血化瘀方案中常用的药物，也是脑血疏的主要成分，其含有多种生物活性成分，具有抗凝、抗炎、脑保护等多种作用，研究[15]表明其提取物含有的游离氨基酸可能是抗凝作用的有效成分，其活性成分作用于凝血过程，抑制凝血酶从而达到抗凝的作用。研究[16]证实，脑出血后血肿释放的大量凝血酶在继发性脑损伤中起着重要作用，而水蛭活性成分所含有的凝血酶抑制成分可能具有阻止凝血酶诱发的脑水肿形成的作用。脑血疏主要成分是黄芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黄、川芎，具有益气活血的功效，用于脑出血的治疗，可以增加脑血流、改善微循环、促进血肿的吸收。

在本项研究中，笔者对脑出血急性期大鼠应用脑血疏治疗。结果显示：1)各组大鼠在术后24 h体质量均有下降趋势，与脑出血损伤有关；72 h后应用低剂量脑血疏组大鼠体质量较对照组增加，差异有统计学意义，提示应用脑血疏能够改善大鼠脑出血术后体质量下降趋势。2)大鼠脑出血术后均出现神经功能缺陷症状，应用低剂量脑血疏组术后48 h和72 h Longa评分均低术后24 h，差异有统计学意义；同时间点不同组间比较，实验组较对照组有降低趋势，差异无统计学意义；提示脑血疏可改善大鼠脑出血术后神经功能评分。在本项研究中，笔者应用3种神经功能评分方法进行研究，其中只有Longa评分获得了阳性结果，可能与有的大鼠的神经功能恢复能力较强以及实验入组大鼠数目偏少有关，必要时需要增加实验动物数目进一步研究。3)凝血四项结果显示：实验组与对照组比较，PT、APTT、TT、INR下降，差异有统计学意义，提示脑血疏可以激活内源性及外源性凝血系统，起到促凝的作用，从而防止血肿进一步扩大；同时，实验组与对照组比较Fib下降，提示脑血疏影响纤维蛋白溶解系统，其数值下降提示血液低凝或纤溶亢进，起到抗凝作用，从而改善微循环、促进血肿吸收。实验组与对照组比较，Fib有下降趋势，目前尚无统计学意义，考虑与实验入组动物数量偏少有关，有待于进一步研究。

该项研究显示脑出血急性期应用脑血疏(低剂量组)可改善大鼠脑出血术后体质量下降和神经功能评分，起到神经保护的作用；其凝血指标的变化提示促凝及纤溶同时存在。由此笔者推测脑出血急性期应用脑血疏治疗能够改善大鼠体质量下降以及神经功能评分，可能通过影响急性期凝血机制，并且与止血、活血均有关，但仍需进一步研究。

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EffectsofNaoxueshuonthebehaviorandcoagulationintheintracerebralhemorrhageinrats

Zhang Ying1,2,Liu Tao1,Yu Rong1,Zhou Ming1,Yan Feng2，Luo Yumin2*

(1.EncephalopathyDepartment,WeifangTraditionalChineseMedicineHospital，Weifang261042，ShandongProvince,China;2.CerebrovascularDiseasesResearchInstitute,XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100053,China)

ObjectiveTo study the protective effect of Naoxueshu in the intracerebral hemorrhage in rats and its effects on the coagulation.MethodsTotally 21 rats were injected with type Ⅳ collagenase were randomly divided into 3 groups,group A,group B and the control group.Group A and B were respectively given high and low concentration of Naoxueshu.We recorded the weight and assessed neurological function before sacrificing the rats at 24 hours,48 hours,and 72 hours,and tested the coagulation parameters finally.ResultsThe weight significantly increased at 24 h compared with that at the 72 h in group A and B (P<0.05).Compared with the control group,the weights significantly increased in group B at 72 h (P<0.05).The neurological function scores in group B were significantly decreased at 24 h，48 h and 72 h (P<0.05).Compared with the control group,the activated partial thromboplastin time (APTT) and International Normalized Ratio (INR) significantly decreased in group B (P<0.05).ConclusionNaoxueshu could improve the weights and the neurological defects in the acute phase of intracerebral hemorrhage in rats,the mechanism maybe associated with its coagulation function.

Naoxueshu;intracerebral hemorrhage;neurological function scores;blood coagulation

*Corresponding author，E-mail：yumin111@ccmu.edu.cn

时间：2017-12-13 21∶25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2125.058.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.013]

R743.34

2017-10-01)

编辑 陈瑞芳