人工基质对凡纳滨对虾免疫和消化相关指标的影响

张 月, 段亚飞, 董宏标, 张真真, 张家松

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306 )

人工基质对凡纳滨对虾免疫和消化相关指标的影响

张 月1, 2, 段亚飞1, 董宏标1, 张真真1, 张家松1

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306 )

将体长1 cm的凡纳滨对虾饲养于池底铺有黑膜的400 m2圆形高位池中，池中沿水流方向与池底垂直悬挂由40目双层筛绢网制成的人工基质(间距约1 m)，其中基质与池底面积之比约为1∶2，常规饲养，分别于养殖第29、57 d和80 d测定对虾肝胰腺中总抗氧化能力、溶菌酶、诱导型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性以及一氧化氮含量的变化，研究人工基质对肝胰腺免疫和消化相关指标的影响。试验结果显示，养殖第29 d，基质添加组对虾的免疫酶活性均显著高于对照组(P<0.05)，消化酶活性变化不显著(P>0.05)；养殖第57 d(台风期间)，基质添加组对虾各免疫指标和淀粉酶活性均显著低于对照组(P<0.05)；养殖第80 d (台风过后26 d)，基质添加组对虾总抗氧化能力、诱导型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性显著升高(P<0.05)。研究表明，人工基质可以显著影响对虾免疫和消化机能，而基质生物膜系统遭台风等强天气干扰破坏后仍具有一定的自我修复能力。

凡纳滨对虾; 人工基质; 免疫; 消化

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，又名南美白对虾，具有生长速度快、抗逆性强、易运输等优点，已成为我国重要的养殖对虾[1]。近年来，随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加，水体污染、疾病频频爆发等问题日益凸显，严重制约了对虾养殖业的健康发展[2-3]。因此，改善养殖环境、寻找健康的养殖模式已成为对虾养殖业发展的趋势之一。

近年来，微生物作为生态系统中的分解者，其在调节养殖水质、改善动物体机能中的作用已成为对虾健康养殖的研究热点。人工基质，也称人工水草，属于生物—生态修复技术领域，在养殖水体中形成一层生物膜状结构，用以吸附各种细菌、藻类及水体中的悬浮颗粒物等[4-5]。研究表明，人工基质作为微生物附着基，显著影响养殖水体菌群数量和结构，为养殖对虾提供额外的栖息场所和食物源[6-7]。此外，笔者之前研究亦发现，人工基质可降低对虾养殖水体中无机氮含量，增强水体菌群结构稳定性，提高对虾成活率和产量[8-9]。目前，人工基质—生物膜技术已成为一种高效的养殖水体原位清洁修复技术，在水产健康养殖中的应用逐渐增多。

然而，目前关于人工基质在对虾养殖中的应用研究主要集中在水质调控、菌群调节和对虾生长性能改善等方面，而其对凡纳滨对虾免疫和消化功能影响的研究相对较少。为此，本研究将筛绢网作为人工基质添加到凡纳滨对虾高位池精养系统中，通过测定对虾免疫和消化酶的活性，以探讨添加人工基质对对虾免疫和消化机能的影响，为人工基质在对虾养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

养殖试验在湛江恒兴南方海洋科技公司863基地进行，随机选择养殖条件相近、池底铺有黑膜的6口400 m2圆形高位池塘。试验池的人工基质为40目双层筛绢网，沿水流方向与池底垂直悬挂(图1)，间距约1 m，基质与池底面积比例约为1∶2。基质全部浸没于水中，四周留有空隙以便对虾和水流通过[5]。未放人工基质的池塘为对照组，每组3个平行。

图1 池塘人工基质设置俯视图[7]

1.2 日常管理

试验养殖高位池经消毒后进水1.5 m，同时投放营养物质培养浮游生物7 d。试验用凡纳滨对虾平均体长1 cm，放苗密度180 尾/m2。养殖水体盐度24～25，pH 8.3～8.7，平均水温31.75 ℃，溶解氧含量始终≥6 mg/L。养殖期间不换水，仅补充蒸发水。饲料粗蛋白含量≥42%，日投喂3次，日投喂量为虾体质量的3%～7%，依摄食情况进行调整。本研究中，养殖第54 d时遭遇14级风力的超级台风“温比亚”，池塘养殖环境受到严重影响，期间中断电力供应6 h。

1.3 样品制备

分别于养殖第29、57 d和80 d从每个平行组随机取5尾虾的肝胰腺，使用预冷的0.86%生理盐水进行漂洗，去除组织液，滤纸拭干，称量质量后置于离心管中。按照1∶10 (m/V)加入预冷的0.86%生理盐水进行超声粉碎。将制备好的10%组织匀浆液于4 ℃，2000 r/min离心10 min，取上清液于-80 ℃保存备用，用于测定免疫和消化指标。

1.4 免疫和消化指标的测定

使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定免疫和消化指标，包括总抗氧化能力、溶菌酶、诱导型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性以及一氧化氮与组织蛋白含量，相关操作按说明书进行，未做任何调整。各项指标测定所用试剂盒均为同批次试剂。

37 ℃时，每分钟每毫克组织蛋白，使反应体系的吸光度值增加0.01时，定义为1个总抗氧化能力单位(U)；溶菌酶活性测定采用比浊法；一氧化氮含量测定采用硝酸还原法，利用硝酸盐显色剂生成红色偶氮化合物来间接测定；诱导型一氧化氮合酶活性主要利用其催化L-精氨酸与O2反应生成一氧化氮，一氧化氮与亲核性物质作用生成有色化合物，通过测定530 nm吸光度进行定量；37 ℃条件下，组织中每毫克蛋白与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位(U)；37 ℃下每毫克组织蛋白每分钟分解蛋白生成1 μg氨基酸定义为1个胃蛋白酶活力单位(U)；组织蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。

1.5 数据分析

试验所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，P<0.05表示组间差异显著。

2 结 果

2.1 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺免疫指标的影响

与对照组相比，基质添加组对虾肝胰腺中总抗氧化能力在养殖第29 d时显著升高(P<0.05)，随后于第57 d显著低于对照组(P<0.05)；养殖第80 d，基质添加组总抗氧化能力显著升高，为对照组的4.11倍(P<0.05) (图2a)。基质添加组对虾肝胰腺中溶菌酶活性于养殖第29 d达到最高值，为对照组的1.67倍(P<0.05)，但第57 d和80 d均显著低于对照组(P<0.05) (图2b)。

图2 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺中总抗氧化能力(a)和溶菌酶(b)活性的影响*表示组间差异显著(P<0.05).下同.

养殖第29 d时，基质添加组对虾肝胰腺中诱导型一氧化氮合酶活性和一氧化氮含量均显著高于对照组，分别为对照组的2.02和2.59倍(P<0.05)；第57 d时显著降低，分别为对照组的0.20和0.54倍(P<0.05)；第80 d时，基质添加组诱导型一氧化氮合酶活性显著高于对照组，而一氧化氮含量差异不显著 (P>0.05) (图3)。

图3 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺中诱导型一氧化氮合酶(a)活性和一氧化氮(b)含量的影响

2.2 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺消化指标的影响

养殖第29 d时，基质添加组和对照组对虾肝胰腺淀粉酶活性差异不显著(P>0.05)；第57 d时，基质添加组淀粉酶活性显著降低，于第80 d活性显著高于对照组(P<0.05) (图4a)。第29 d和57 d时，基质添加组对虾肝胰腺胃蛋白酶活性均与对照组差异不显著(P>0.05)，而第80 d时显著高于对照组(P<0.05) (图4b)。

图4 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺中淀粉酶(a)和胃蛋白酶(b)活性的影响

3 讨 论

在对虾养殖系统中应用人工基质—生物膜技术，除了可以为对虾提供栖息场所，还可以吸收转化污物、维护良好水质、补充饵料和控制水体弧菌(Vibrio)丰度等[5,7,10]。人工基质表面生物膜的组成十分复杂，包括饲料残饵、粪便等有机碎屑，各种藻类，浮游动、植物等，甚至会有原生动物。这些丰富的生物群体是一种优质的高蛋白质生物饵料，可以为对虾提供额外的蛋白营养来源[4]。有研究表明，添加人工基质可以为对虾提供额外的饵料补充，提高对虾的特定生长率和产量[11-12]。

3.1 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺免疫指标的影响

对虾缺乏获得性免疫系统，主要依靠各类非特异性免疫因子来识别异己，抵御环境胁迫或病原感染。总抗氧化能力是评价机体抗氧化防御系统功能的综合性指标[13-15]。溶菌酶是一种重要的抗菌蛋白，其活性可以作为衡量对虾非特异性免疫功能的指标[16-17]。一氧化氮是一种生物体内的自由基，主要由诱导型一氧化氮合酶催化L-精氨酸与O2反应产生，通过与氧自由基结合生成强氧化剂或者抑制微生物代谢酶的活性来杀灭微生物[15,17]。李桂英[18]研究表明，饲料中添加益生菌及其灭活菌体能显著提高养殖对虾诱导型一氧化氮合酶的活性。在养殖系统中添加甘蔗渣，第34 d时养殖凡纳滨对虾的溶菌酶活性显著高于对照组[19]。本研究中，养殖第29 d时，基质添加组对虾肝胰腺中总抗氧化能力、溶菌酶活性、诱导型一氧化氮合酶活性和一氧化氮含量均显著升高，表明添加人工基质有助于增强养殖对虾肝胰腺的免疫防御机能。

3.2 人工基质对凡纳滨对虾肝胰腺消化指标的影响

肝胰腺分泌的消化酶活性可以作为对虾消化机能的评价指标。本研究中，在养殖系统中添加人工基质筛绢网后，第80 d凡纳滨对虾肝胰腺中淀粉酶和胃蛋白酶活性显著升高，表明人工基质显著影响凡纳滨对虾的消化功能。不同免疫或消化指标的变化不同，可能与所用人工基质材料、对虾生长期和投喂饲料等差异有关。

3.3 强天气干扰对人工基质的影响及其自我修复

胡晓娟等[20-21]研究表明，热带风暴和台风等强降雨天气干扰会降低池塘养殖水体pH和盐度，大量滋生病原微生物，导致对虾产生应激反应，免疫能力降低，发病及死亡机率增加。本研究中，对虾养殖第54 d时遭遇超级台风“温比亚”，严重影响了池塘养殖环境。课题组前期研究表明，台风“温比亚”导致的池塘环境骤变，严重破坏了人工基质生物膜系统，使其分解能力下降，基质添加组养殖水体氨氮、亚硝态氮和弧菌含量显著升高，导致池塘水体生态系统崩溃，引起对虾大量死亡[10]。姜令绪等[22]研究发现，养殖水体氨氮含量的剧烈波动会降低对虾机体免疫力。本研究中，养殖第57 d基质添加组对虾肝胰腺总抗氧化能力、溶菌酶和诱导型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮含量、淀粉酶活性均显著低于对照组，同样佐证了台风“温比亚”破坏人工基质生物膜系统，造成对虾免疫和消化功能紊乱。董宏标等[9]研究表明，人工基质生物膜中生物群落的成熟是较为缓慢的自然驯化过程，一般需要约30 d才能够完成。本研究中，养殖第80 d时，基质添加组对虾肝胰腺中总抗氧化能力、诱导型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性再次显著升高，表明台风“温比亚”袭击后26 d，基质生物膜系统已基本完成重建过程，水体氨氮含量逐渐下降，对虾免疫和消化机能基本可以恢复正常。

综上所述，添加人工基质显著影响了凡纳滨对虾肝胰腺免疫和消化指标，而台风前后基质添加组对虾免疫和消化指标严重分化，表明人工基质可能更适用于天气波动较小的季节或室内对虾养殖。此外，人工基质生物膜系统遭受台风等强天气干扰破坏后，具有一定的自我修复能力。本研究可以为人工基质在对虾养殖中的应用研究提供参考。

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EffectofArtificialSubstrateAdditiononImmuneandDigestiveRelatedIndicatorsinPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

ZHANG Yue1,2, DUAN Yafei1, DONG Hongbiao1, ZHANG Zhenzhen1, ZHANG Jiasong1

( 1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China )

The total antioxidant capacity (T-AOC), activities of lysozyme (LSZ), nitrio oxide synthase (iNOS), amylase, and pepsin, and the content of nitrio oxide (NO) were monitored in hepatopancreas of Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannameiwith body length of 1 cm reared in a 400 m2circular pond in which a double-layer artificial substrate made of 40 mesh size sieve screen was suspended spacing of about 1 m along the direction of the water flow in 29 d, 57 d and 80 d during the culture to investigate the effect of artificial substrate on the immune and digestive related indicators of the shrimp. The results showed that comparing with the control group, the shrimp in artificial substrate-treated group had significantly higher immune enzyme activities on the 29th day (P<0.05), while the digestive enzyme activities have no significant difference (P>0.05). On the 57th day of rearing during the typhoon period, all the immune indices and amylase activity in artificial substrate-treated group were decreased significantly (P<0.05), but T-AOC, iNOS and amylase activities were increased on the 80th day (26 days after typhoon period) (P<0.05). The findings indicated that artificial substrate significantly improved the immune and digestive abilities of the shrimp, and that the substrate-biofilm has a certain ability to repair itself after the damage of severe weather such as typhoon.

Litopenaeusvannamei; artificial substrate; immune; digestion

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.010

S968.22

A

1003-1111(2017)04-0462-05

2016-05-17；

2016-08-24.

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国水产科学研究院南海水产研究所)资助项目(2016TS07);广东省海洋渔业科技与产业发展专项项目(A201501B15, A201508B05)；广东省自然科学基金资助项目(2015A030310393).

张月(1992—)，女，硕士研究生；研究方向：对虾健康养殖技术. E-mail: zhangyue9236@163.com. 通讯作者：张家松(1971—)，男，副研究员；研究方向：对虾健康养殖技术. E-mail: jiasongzhang@hotmail.com.