联峰山油松枯梢病病原菌越冬方式及场所的研究

任晓婧，杜金顺，崔建州，暴可心，李会平

(1.河北农业大学林学院，河北 保定 071000; 2.河北省阜平县林业局，河北 阜平 073200; 3.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

联峰山油松枯梢病病原菌越冬方式及场所的研究

任晓婧1,3，杜金顺2，崔建州1,3，暴可心1,3，李会平1,3

(1.河北农业大学林学院，河北 保定 071000; 2.河北省阜平县林业局，河北 阜平 073200; 3.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

为了明确油松枯梢病病原菌Sphaeropsissapinea的越冬方式及场所，于2015年11月—2016年3月越冬季节田间采集油松PinustabulaeformisCarr.的松针、松梢、球果等越冬组织及林下的落针、落果等，观察子实体着生情况，测定越冬子实体内孢子萌发率，发现油松枯梢病的病原菌可以子实体的形式在松针和落针上越冬。通过对以上组织进行室内病原菌的分离、分子生物学检测，确定该病菌也可以菌丝体的形式在发病的针叶、球果、松梢和落针、落果中越冬。

油松枯梢病;球壳孢菌;越冬方式;越冬场所

油松PinustabulaeformisCarr.为松科松属针叶常绿乔木，广泛分布于我国东北、华北、西北及河南、山东、江苏等地，常用于造林和景观建设[1]。但是近些年来，油松枯梢病在华北一带发生，尤其河北省秦皇岛市联峰山森林公园景区危害严重。该病害自2004年在联峰山发生以来，呈现逐年加重趋势，目前发生率70%以上。其症状主要表现为发病初期枝梢黄色或微红色枯败，后期呈灰白色丛状枯死，下垂且不落，枯死树随处可见，存活树几乎株株布满枯枝败叶，严重影响了景区的景观效果，给当地的经济及生态景观造成了极大破坏[2]。

该病害的病原为半知菌亚门腔孢纲球壳孢目球壳孢属真菌Sphaeropsissapinea[3]。病原物越冬是植物病害侵染循环的一个重要环节，病原物在越冬期间处于休眠状态，而且潜伏场所比较固定，是侵染循环中的一个薄弱环节，掌握这个环节常常是某些病虫害防治上的关键所在。病原物越冬方式多种，营养体、各种孢子、子实体、菌核、菌索等都可以在一定条件下度过不良环境[4]。越冬场所也因病原、发生部位等不同而不同。有病落叶是许多叶部病害病原物的越冬场所，落叶松早期落叶病、松落针病等的病原物以菌丝体在落叶中越冬[5-8]。金丝小枣浆烂果病的有性世代的子囊壳与子囊孢子只发现于越冬后的病枣果中[9]。油茶炭疽病可以在地面有病落果中越冬[10]。毛竹枯梢病菌以菌丝体、子囊孢子和分子孢子形态越冬,以病组织中菌丝体为越冬主要形式[11]。

关于联峰山公园发生的油松枯梢病病原菌的越冬场所及方式，目前还未见相关报道，在一定程度上制约了其有效防治。作者研究油松枯梢病病原菌的越冬方式及其越冬场所，以期为油松枯梢病的监测预报提供一定的理论依据，并为防治该病起到一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 采样 2015年11月至2016年3月，在病害发生严重的秦皇岛市联峰山公园采集油松的松针、松梢、球果等越冬组织及林下的落针、落果，装入无菌纸袋,做好标记带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 越冬病原菌子实体观察 对上述不同时间采集的不同越冬组织，借助放大镜观察是否有油松枯梢病病原子实体，做好详细记录。根据以下公式计算子实体率。

子实体率(%)=

1.2.2 越冬病原子实体萌发测定 从带有油松枯梢病病原子实体的标本随机抽取200个样品，测定其孢子萌发情况。方法如下，将子实体取出、压碎，获得分生孢子，制成孢子悬浮液，使每个视野内的孢子数在80～100个，用悬滴法测定孢子萌发率。每个处理5次重复，在25℃恒温下培养，每2 h观察1次，每次观察5个视野，计算平均值。孢子萌发标准：以芽管长度超过孢子直径长度(指直径最小的一边)的一半，视为已经萌发的孢子。

1.2.3 越冬病原营养体的分离培养 在调查地点采集已发病但无子实体的油松针叶、松梢、球果及其树下的落针、落果。共选择针叶100枚、松梢50个、球果100个、落针和落果各100个进行分离试验。将样品切成小块(1～2 cm)，用清水清洗干净后在超净工作台中参照《植病研究方法》[12]进行分离。具体操作如下：将样品小块浸泡在75%的酒精中30 s，用0.1%的升汞消毒3 min，无菌水冲洗3次(为检测消毒是否彻底，取第3次洗涤液100 μL，均匀涂抹在PDA培养基表面,观察是否有微生物长出)。取PDA培养基倒入无菌培养皿中，每皿接入消毒的样品小块，在LRH—250—G光照培养箱中25℃恒温培养，每天观察1次并记录培养菌落的形状、色泽等，与该病害病原菌的菌落特征进行对比，排除其他菌类，并记录各分离株的分离率，从而确定油松枯梢病病原菌菌丝体主要的越冬场所。

1.2.4 越冬病原营养体的分子检测 对从越冬病原营养体中分离的菌株分别提取其DNA，并以其为模板，采用ITS通用引物(ITS1∶5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′和ITS4∶5′-TC-CT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′)对菌株的rDNA ITS序列进行PCR扩增。对此片段进行DNA序列测定，DNA提取及测序工作由大连宝生物工程有限公司完成。同时以该病害病原菌分离菌株的DNA序列作为对照，将所测菌株的基因序列和对照菌株的基因序列用DNAMAN软件进行同源性比较分析，最后确定菌株的种类是否属于油松枯梢病病原菌。

2 结果与分析

2.1 子实体在松树不同部位的越冬 分别于2015年11月、2016年1月和2016年3月3次调查，在松梢、球果及落果中均未发现病菌的子实体。而在树上针叶和落地针叶中均有子实体存在，存在率分别为77.93%～85.00%和75.15%～78.97%(表1)。说明油松枯梢病病原菌以子实体的形式在发病针叶和落针中越冬。

表1 子实体越冬在油松各部位的着生率 %

2.2 松树不同部位越冬病原子实体的萌发 测定越冬期间不同部位子实体内分生孢子的萌发情况，以确定越冬病原的活力及侵染能力。越冬针叶和落地针叶上子实体萌发情况分别见图1和图2。

由图1和图2看到，在病针叶和落针上子实体萌发规律基本一致，处理后2 h时，即有少量孢子萌发，随着时间的延长，萌发率逐渐上升，至19 h时萌发率基本稳定。2015年11月、2016年1月和3月3次试验中，病针叶上19 h时的孢子萌发率分别为76.5%，75.4%，77.1%，落针中孢子萌发率分别为77.5%，74.7%，76.3%。说明越冬期间的子实体无论在病针叶中，还是落针中均保持较高的萌发率，可以作为第2年的侵染来源。

图1 不同处理时间病针叶上越冬分生孢子萌发率

图2 不同处理时间落针上越冬分生孢子萌发率

2.3 病原菌营养体在不同部位的分离 在越冬期间分3次在不同越冬部位分离到的出现频次较高的真菌有8种，病原菌的分离率最高。

从图3可以看出，不同时间在各个越冬部位均能分离到病原菌，且分离率差异不显著。说明油松枯梢病病原菌可以菌丝体的形式在发病的针叶、球果、松梢和落针、落果中越冬。

图3 在油松不同部位越冬的病原菌分离率

2.4 不同部位越冬病原营养体的分子检测 对2.3中分离到的所有真菌进行ITS序列分析，结合形态学特点，进行鉴定(表2)。在所有分离到的真菌中，除病原菌分离率最高外，还有7种出现频率较高，在不同部位均能分离到，分别为植物内生菌Paraphaeosphaeriasp.、哈茨木霉Trichodermaharzianum、链格孢Alternariaarborescens、互隔交链孢霉Alternariaalternata、木霉Trichodermalixii、钩状木霉Trichodermahamatum、类腊肠茎点霉Allantophomopsislycopodina。在这7种真菌中，分离率亦不相同，其中Paraphaeosphaeriasp.在不同时间不同部位的分离率均明显高于其他真菌，为常驻菌群[17-18]。

表2 在油松不同部位越冬的8种真菌的分离率 %

3 小结与讨论

通过对油松上发病的针叶、球果、松梢和落针、落果进行子实体分离、孢子萌发试验确定油松枯梢病病原菌以子实体形式在冬季发病油松的针叶和落针上越冬，室内组织分离试验确定了油松枯梢病病原菌也以菌丝体的形式越冬，越冬场所为油松发病的松针、松梢、球果和落针、落果。

确定病原菌的越冬方式对病害的控制有重要的指导意义，根据上述研究结果，冬春季节及时清除落叶、落果，并结合抚育、间伐等工作，对病弱枝和球果等进行疏枝、修剪，可有效降低越冬病原菌基数，减少初侵染源，对控制油松枯梢病的扩展蔓延具有重要意义。

分离试验中从油松发病的松针、松梢、球果和落针、落果中除分离到病原菌外，Paraphaeosphaeriasp.的分离率在各个部位也较高。对Paraphaeosphaeriasp.进行接种试验，其不能使油松致病。经查阅文献，该菌为一种常见的植物内生菌[13-14]，分离率很高，推测该内生菌在油松的生长及抗逆等方面有一定的作用，具体还有待进一步研究。

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StudyontheoverwinteringformsandsitesofthepathogenoftipblightofPinustabulaeformisinLianfengMountain/

REN Xiaojing,et al.

(College of Forestry,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

To manifest the overwintering forms and sites of pathogen of tip blight ofPinustabulaeformis,from Novenmber of 2015 to March of 2016,the needles,shoots,cones,fallen needles and fallen cones were collected to observe the fruiting body of the pathogen,and determined the conidia germination.The results showed that the pathogen could overwinter on needles and fallen needles in the form of fruiting body.By means of isolation and molecular analysis of the pathogen,we found that the pathogen could also overwinter in the needles,shoots,cones,fallen needles and fallen cones in the form of mycelium.

tip blight ofPinustabulaeformis;sphaeropsis sapinea;overwintering forms;overwintering sites

2016-07-28

林业公益性行业科研专项(201504306) “油松林枝梢丛状枯死的成因及防控技术研究”

任晓婧(1990—)，女，黑龙江省伊春市人，在读研究生，主要研究方向为森林有害生物综合治理，E-mail：814625011@qq.com

李会平，教授，主要从事森林病虫害防治研究，E-mail：805737255@qq.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0035-03

(责任编辑 杨静莉)