我国部分省(区)猪圆环病毒3型的分子流行病学研究

2017-12-15刘晓东杨旭兵郑庆礼马震乾刘红祥王福军杨佳丰杜元钊王全溪

动物医学进展 2017年11期

刘晓东，杨旭兵，郑庆礼，马震乾，刘红祥，王福军，杨佳丰，高丰，杜元钊，王全溪

(1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062；2.福建农林大学动物科学学院，福建福州 350002; 3.福州康欣农牧有限公司，福建福州 350002；4.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266000)

刘晓东1,4，杨旭兵4，郑庆礼2，马震乾4，刘红祥4，王福军4，杨佳丰3，高丰1*，杜元钊4，王全溪2

2016年美国报道了一种可引起猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍、呼吸道及高热等多系统炎症的新型病毒猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)。为了解我国PCV-3的感染情况,针对PCV-3保守区设计一对特异性引物，对10个省106份样品进行PCR检测并测序分析。结果表明,10个省(区)中6个省(区)为阳性，地区阳性率60%；66个猪场中感染PCV-3的猪场为12个，猪场阳性率为18.2%；106个样品中检测PCV-3阳性的样品为19例，样品阳性率为18.0%。研究结果为更多了解PCV-3在我国感染情况提供了数据基础。

猪圆环病毒3型；PCR检测；分子流行病学

猪圆环病毒(Porcine circovius,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员，是目前已知最小的动物病毒。PCV为无囊膜、单链环状、DNA病毒，病毒颗粒呈20面体对称结构，直径大约17 nm～20 nm，病毒复制以滚环方式进行[1]。Meehan B等[2-4]等将PCV分成PCV-1 和PCV-2 两种血清型。PCV-1 不能引起猪发病，但是PCV-2不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，而且还与猪皮炎与肾病综合征、猪先天性震颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从发现PCV-2可致猪发病以来，该病毒在世界各国迅速蔓延，给养猪业造成了巨大的经济损失。 2015年-2016年，Palinski R等[5-6]两个实验室基本同时报道了在美国北卡罗来纳州、美国密苏里州、明尼苏达州、南达科他州送检猪体检测出了一种新的病毒，经鉴定为PCV-3。这种新型圆环病毒基因组全长为2 kb，现已成为猪圆环病毒家族的又一新成员。为了解PCV-3在我国猪场中的情况，本研究采用PCR方法对我国10省(区)106份发病猪样品进行了PCV-3的分子流行病学检测与分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料分别从安徽、江西、山东、福建、广西、黑龙江、河南、吉林、湖北、海南10省(区)66个不稳定猪场采集病料(肺、脾脏、淋巴结)106份。

1.1.2 主要试剂组织/细胞DNA提取试剂盒购自Whatson公司；动物组织总RNA提取试剂盒购自北京天根生物技术公司；反转录试剂盒购自北京普洛麦格公司；PCR MIX,DNA Marker等购自TaKaRa(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计根据GenBank中PCV-3序列(KX778720.1)，在其高度保守区域设计一对特异性引物：F:5′-3′CGACGGCGGGAATCTGACTGA,R:5′-3′TACCCATTTAAACATGGACCA，扩增片段为260 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA提取与PCR扩增按照动物/细胞DNA试剂盒提取病料总DNA。将病料混合加液氮研磨，加入蛋白酶K 55℃裂解，RNaseA除去RNA，然后上柱，按说明书步骤进行。PCV-3的PCR扩增反应采用50 μL体系，反应程序为95℃ 5 min；95℃ 30 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min，扩增产物经30 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 测序分析 PCR阳性样品的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果利用DNA Star软件进行比对，绘制遗传进化树分析。

1.2.4 混合感染情况的分析为了进一步了解PCV-3与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、PCV-2的混合感染情况，分别对所有病料提取RNA和DNA，PCR检测。引物分别为：猪瘟F:5-AGGAGCCCGTATTTCTGGA-3,R:5-CCCTTGATGCTTGATCTTGTG-3,扩增片段478 bp;猪蓝耳病F:5-GCGTCCTCACAGACGGAATA-3,R:5-CGCCGAGAAGACCCAGA-3,扩增片段1 004 bp;猪伪狂犬F:5-CGGATCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGAC-3,R:5-GAAGGCGTCGACGGGTCAGGCGGTCAG-3,扩增片段1 245 bp; PCV-2:F:5-TTACCGGCGCACTTCGGCAG-3,R:5-ACTCCGTTGTCCCTGAGAT-3,扩增片段404。

2 结果

2.1 PCR检测结果

利用所设计的PCV-3引物进行PCR扩增，结果表明可扩增出1条约260 bp条带(图1)，与预期片段大小相符。

2.2 临床病料的PCV-3检测

对来自全国10个省(区)65家猪场的106份病料进行检测，结果显示，10个省(区)中，6个省(区)为的病料PCV-3阳性，地区阳性率60%；66个猪场中感染PCV-3的猪场为12个，猪场阳性率为18.2%；106个样品中检测PCV-3阳性的样品为19例，样品阳性率为18.0% (表1,图2)。19例PCV-3阳性病例中存在高热呼吸道症状的为5例，消瘦与生长缓慢的为7例，急性死亡的为2例，繁殖障碍的为5例。

1～2.阳性样品; 3.阴性样品 M.DNA 标准 DL 1 000

1-2.Positive samples; 3.Negative sample M.DNA Marker DL 1 000

图1 PCR检测结果

Fig.1 Detection results of PCR

M.DNA 标准 DL 1 000；A.阳性对照；B.阴性对照； 1～19.阳性检测样品M.DNA Marker DL 1 000；A.Positive control samples；B.Negative control sample； 1-19.Positive samples

编号№省份Province猪场/个FarmPCV-3阳性场/个PCV-3positivefarm样品数/个SamplesPCV-3阳性样品数/个PCV-3positivesamples猪场阳性率/%Positiverateoffarms样品阳性率/%Positiverate1安徽Anhui314133.325.02江西Jiangxi427350.042.63山东Shandong26450915.418.04福建Fujian8313337.523.15河南Henan1111619.106.256广西Guangxi315233.340.07黑龙江Helongjiang4040008吉林Jilin2020009湖北Hubei30300010海南Hainan202000合计Total1066121061918.218.0

2.3 遗传进化树分析

选择13份阳性病料的PCR产物进行测序，序列分析结果表明，13份阳性的毒株与参考毒株在同一分支中均属于PCV-3(图3)，同源性均大于98%(图4)。13份病料虽均为PCV-3，但不同区域毒株也存在一定差异,如江西毒株(JXXY3)。

□表示基因库中的参考序列 □Reference sequence in GenBank

图4 同源性分析

2.4 PCV-3混合感染的结果

对106份可疑样品通过PCR检测，结果CSFV与PRRSV混合感染为5例，CSFV与PCV-2混合感染为1例，CSFV与PCV-3混合感染为5例，PRRSV与PCV-2混合感染为9例，PCV-2与PRV混合感染为4例，PCV-2与PCV-3混合感染为3例，CSFV+PRRSV+PCV-2混合感染为4例，CSFV+PRRSV+PRV混合感染为1例，CSFV+PRRSV+PCV-3混合感染为1例，CSFV+PCV-2+PCV-3混合感染为3例(图5)。可见临床上PCV-3存在与其他病毒混合感染的现象。

图5 混合感染检测结果

3 讨论

对全国10个省(区)的病例检测中，6个省(区)为阳性，地区阳性率60%；66个猪场中感染PCV-3的猪场为12个，猪场阳性率为18.2%。因此提示，全国部分省(区)PCV-3已成流行趋势，地域分布特点不明显，这与文献[7-8]的研究结果一致。本研究团队认为应更加重视PCV-3的监控及研究工作。通过对106个样品进行检测，发现19个阳性病例中PCV-3单独发生为7例，其余均为混感，其中CSFV与PCV-3混合感染为5例，PCV-2与PCV-3混合感染为3例，CSFV+PRRSV+PCV-3混合感染为1例，CSFV+PCV-2+PCV-3混合感染为3例。通过本研究可以推断，PCV-3与CSFV以及PCV-2的混感率要高于其他疾病。对于PCV-3的起源有文献指出，PCV-3与蝙蝠圆环病毒在遗传进化关系上相近[7]，PCV-3是直接来源于蝙蝠，还是与猪体内的其他圆环病毒重组而来，需要进一步研究分析。通过19个阳性案例分析发现，高热与呼吸道的病例为5例，消瘦及体况差的病例为7例，急性死亡的病例为2例，繁殖障碍的病例为5例，此结果的出现可能跟PCV-3与其他疾病混感率比较高有关，何启盖研究发现的PCV-3具有致母猪繁殖障碍的症状[7]与本研究团队统计的症状具有一致性[7]。中国作为世界养猪大国，猪病的监测、病原的致病、流行病学调查等对于疾病的有效防控至关重要，本研究通过对PCV-3的流行病学的调查，可为进一步对PCV-3的研究工作和防控措施提供数据基础。

[1] Tischer I,Gelderblom H,Vettermann W,et al.A very small porcinevirus with circular single stranded DNA[J].Nature,1982,295:64-66.

[2] Meehan B,McNeilly F,Todd D,et al.Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs [J].J Gen Virol,1997,79:2171-2179.

[3] Allan G M,Meehan B,Todd D,et al.Novel porcine cirecovirus from pigs with wasting disease syndrome[J].Vet Rec，1998,142:467-468.

[4] Allan G M,McNeilly F,Meehan B,et al.Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain,Denmark and Northern Ireland[J].Vet Microbiol,1999,66:115-123.

[5] Palinski R,Pieyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J].J Virol,2016,91(1):doi:10.1128/JVI01879-16.

[6] Phan T G,Giannitti F,Rossow S,et al.Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs with cardiac and multisystemic inflammation[J].Virol J,2016,13(1):184.

[7] Ku X,Chen F,Li P,et al.Identification and genetic characterization of porcine circovirus type 3 in China[J].Transb Emerg Dis,2017,64(3):703-708.

[8] Shen H,Liu X,Zhang P,et al.Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China[J].Transb Emerg Dis,2017.doi:10.1111/tbed.12639.

MolecularEpidemiologyofPorcineCircovirusType3inSomeProvincesofChina

LIU Xiao-dong1,4,YANG Xiu-bin4,ZHENG Qing-li2,WANG Fu-jun4,LIU Hong-xing4,YANG Jia-feng4,GAO Feng1,DU Yuan-zhao4,WANG Quan-xi2

(1.CollegeofVeterinaryScience,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin,130062,China；2.CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian,350002,China; 3.FuzhuoKangxinBioengineeringCo.，Fuzhou,Fujian,350002,China; 4.QingdaoYebioBioengineeringCo.，Ltd,Qingdao,Shandong,266000，China)

In 2016,a new virus was identified with porcine circovirus type 3 (PCV-3) that caused porcine dermatitis and nephropathy syndrome,reproductive disorders,respiratory disease and high fever and so on in the United States.In order to investigate the infection of PCV-3 in China,a pair of specific primers were designed according to the conserved sequence of PCV 3.106 samples collected from ten provinces were detected by PCR,and the PCR products were sequenced and analyzed.The results showed that there were 6 PCV-3 positive provinces from 10 provinces,the positive rate was 60%.And there were 12 PCV-3 positive swine farms from the 66 swine farms,the positive rate was 18.2%.There were 19 PCV-3 positive cases from 106 samples,the positive rate was 18.0%.This study provided the basis data of PCV-3 infection situation in our country.

Porcine circovirus type 3; PCR detection; molecular epidemiology

2017-05-05

福建农林大学发展基金项目(KF2015094);国家重点研发计划资助项目(2016YFD0500707)

刘晓东(1984-)，男，山东青岛人，博士研究生，主要从事动物病理学研究。*

S852.659

1007-5038(2017)11-0018-04