络风宁1号方对心肌梗死大鼠血栓调节蛋白-活化蛋白C-内皮细胞蛋白C受体系统的调节作用

孙天，王显

络风宁1号方对心肌梗死大鼠血栓调节蛋白-活化蛋白C-内皮细胞蛋白C受体系统的调节作用

孙天1，王显2

目的探讨络风宁1号方对心肌梗死大鼠血栓调节素-活化蛋白C-内皮细胞蛋白C受体系统的调节作用。方法将SD大鼠随机分为假手术组（7只）、模型组（8只）、络风宁1号方组（7只）、联合用药组（8只）、卡托普利组（8只），心肌梗死造模后络风宁1号组及联合用药组予含生药量4.81 g/（kg·d）的络风宁1号方汤剂，卡托普利组及联合用药组予卡托普利片7.5 mg/（kg·d），假手术组及模型组予相同体积蒸馏水，2/d，连续4周。4周后测定各组大鼠心肌梗死边缘组织血栓调节蛋白（TM）、活化蛋白C（APC）、内皮细胞蛋白C受体（EPCR）基因及蛋白的表达。结果模型组大鼠EPCR、TM的mRNA、sEPCR、sTM含量较假手术组明显升高（P＜0.05），EPCR、TM的蛋白表达及APC含量较假手术组下降（P＜0.05）；络风宁1号组、联合用药组EPCR、TM的mRNA以及含量较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），EPCR蛋白表达较模型组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；络风宁1号组、联合用药组血清APC含量较模型组增加（P＜0.05）。结论络风宁1号方能够减轻膜结合型EPCR、TM的损伤，抑制了TM、EPCR的mRNA代偿性增加，使sEPCR、sTM含量下降，APC含量增加。

心肌梗死；络风宁1号方；血栓调节蛋白；活化蛋白C；内皮细胞蛋白C受体；大鼠

急性心肌梗死是一种严重危害人类健康的心血管疾病，目前研究认为血管内皮功能障碍与冠心病进程密切相关[1]。改善内皮抗凝和抑制血栓功能在冠心病研究中已成为热点。血管内皮细胞通过其抗凝作用维持血液正常流动，其主要与血栓调节蛋白-活化蛋白C-内皮细胞蛋白C受体系统（TM-APC-EPCR）相关[2]。王显教授创新提出动脉粥样硬化“络风内动”学说，认为络风内动是冠心病发病的又一重要病机，前期研究表明络风宁1号具有抑制炎症因子、改善血管内皮功能等作用[3,4]。本研究观察急性心肌梗死大鼠心肌梗死边缘组织及血清中TM、EPCR、APC表达变化及络风宁1号方对此干预作用，进一步探讨络风宁1号方TM-APC-EPCR系统的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠50只，SPF级，体重（250±10）g，由北京维通利华实验动物中心提供，实验动物许可证编号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物和主要试剂

络风宁1号方组成：徐长卿、地龙、三七、冰片组成（剂量保密），北京中医药大学东直门医院药房提供；卡托普利片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号：1306032）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：F3056114）；戊巴比妥钠（上海新亚药业有限公司，批号：H31021742）；超纯RNA提取试剂盒（CW0581）；HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（CW0744）；UltraSYBR Mixture（With ROX）（ CW0956）；DNase 1（CW2090）；5x RNA Loading Buffer（CW0611A）均购自CWBIO公司；TM抗体（批号：G1607）；EPCR（批号：A2714）；均购自Santa Cruz公司；辣根酶标记兔抗山羊IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZB2306，）；APC酶联免疫试剂盒（批号：148932）；TM酶联免疫试剂盒（批号：162321）；EPCR酶联免疫试剂盒（批号：162013），均购自北京尚柏生物工程有限公司；GAPDH单克隆抗体（美国Sigma公司，批号：051M5971）。

1.3 主要仪器

电子天平（上海精密科学仪器有限公司，JA1003N型）；十二导心电图机（北京福田电子医疗仪器有限公司，FX-7202型）；呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司，ALC-V8型）；4℃离心机（上海沪粤明科学仪器有限公司，TGL-16G型）； 荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，ABI7500型）；电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-6C型）；转膜仪（北京市六一仪器厂，DYCZ-40D型）。

1.4 模型制备

采用大鼠左冠状动脉前降支结扎的方法制备大鼠心肌梗死模型。用1%的戊巴比妥钠腹腔注射（0.5 ml/100 g）全身麻醉后，背部固定在手术板上，行经喉气管插管术，连接呼吸机，以80 次/min，吸呼比1:2，潮气量0.7～0.8 ml辅助呼吸。在左侧第三、四肋间切开皮肤，逐层钝性分离肌层，撕裂心包膜使心脏充分暴露，进针位置在主动脉根部约3 mm处，用5/0带线缝合针结扎左冠前降支，当心电图I导联显示ST段显著抬高后，肉眼观察结扎部位以下心肌变灰白，搏动减弱。彻底止血后逐层缝合关闭胸腔。假手术组手术过程相同，仅穿线不结扎。术后肌肉注射青霉素连续3 d。手术全部过程严格无菌操作。

1.5 动物分组与给药

38只SD大鼠称重并进行随机分为假手术组（7只）、模型组（8只）、络风宁1号组（7只）、联合用药组（8只）、卡托普利组（8只），造模后络风宁1号组及联合用药组给予含生药量4.81g/（kg·d）的络风宁1号方汤剂，卡托普利组及联合用药组予卡托普利片7.5 mg/（kg·d），假手术组及模型组予相同体积蒸馏水。各组均每天灌胃两次，连续给药4周。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 实时荧光定量PCR法检测EPCR、TM mRNA的表达 采用超纯RNA提取试剂盒提取大鼠心肌梗死边缘区组织中总RNA。引物由上海生工设计并合成，TM引物序列（长度276bp），上游：TCATCCTGGACGAGGGTTC，下游：GTCGGATTGCTTGATGGGT；EPCR引物序列（长度217bp），上游：TCTACCTGTCCCAGTTCAA，下游：C A T A C C G A G T C C G A T T G T；G A P D H引物序列（长度1 3 8 b p），上游：TGGAGTCTACTGGCGTCTT，下游：TGTCATATTTCTCGTGGTTCA。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，以cDNA为模板进行PCR反应：2×UltraSYBR Mixture 10μl，上下游引物 各0.4 μl，cDNA 2 μl，加入灭菌蒸馏水至20μl。扩增程序为：95℃10 min，（95℃15sec，60℃60sec）×45个循环，进行实时荧光定量PCR，进行PCR溶解曲线分析，每个样品设立3个复孔，取平均值，CT值采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.6.2 Western blot检测EPCR、TM蛋白的表达从液氮罐中取保存的大鼠心肌梗死边缘组织，用裂解液提取总蛋白，进行蛋白定量，静SDSPAGE电泳，转膜，封闭后，加入一抗（TM：1:200；EPCR：1:100；GAPDH：1:2000），与二抗孵育（1:2000），37℃孵育1 h，加ECL超敏发光液，暗室发光、显影、定影，将曝光后的X光片在扫描仪上进行扫描，得到的目的蛋白条带的图片用Image J软件进行灰度分析，以目标（EPCR、TM）灰度值与内参（GAPDH）灰度值的比值来表示。

1.6.3 酶联免疫法检测血清EPCR、TM、APC含量 大鼠于术后4周各组大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，采用酶联免疫法对血清EPCR、TM、APC的含量进行测定，测定过程严格按照试剂盒说明进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计分析软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死边缘区组织EPCR、TM mRNA表达比较

与假手术相比，卡托普利组EPCR mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），而模型组、络风宁1号组及联合用药组较假手术组均升高（P＜0.05）；与模型组比较，假手术组、络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组EPCR mRNA的表达量均下降（P＜0.05）；与卡托普利组比较，模型组、络风宁1号组EPCR mRNA的表达量均升高（P＜0.05），假手术组EPCR mRNA表达量较低、联合用药组与卡托普利组近似，均无统计学意义（P＞0.05），表1。

与假手术相比，联合用药组、卡托普利组TM mRNA差异无统计学意义（P＞0.05），而模型组、络风宁1号组较假手术组均升高（P＜0.05）；与模型组相比，假手术组、络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组TM mRNA的表达量均下降（P＜0.05）；与卡托普利组比较，模型组、络风宁1号组TM mRNA表达量均显著升高（P＜0.05），而假手术组、联合用药组TM mRNA的表达量低且无统计学意义（P＞0.05），表1。

2.2 各组大鼠心肌梗死边缘区组织EPCR、TM蛋白表达比较

与假手术相比，模型组EPCR蛋白表达量下降（P＜0.05），络风宁1号方、联合用药组、卡托普利组EPCR蛋白表达量增加（P＜0.05）；与模型组相比，假手术组、络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组EPCR蛋白表达量均增加（P＜0.05）；与卡托普利组比较，络风宁1号方EPCR的表达下降但无统计学意义（P＞0.05），假手术组、模型组EPCR的表达下降（P＜0.05），表2。

与假手术相比，络风宁1号组、卡托普利组TM蛋白表达量下降但无统计学差异（P＞0.05），模型组TM蛋白表达量下降（P＜0.05）；与模型组相比，络风宁1号TM蛋白表达量均增加但无统计学差异（P＞0.05），假手术组、联合用药组、卡托普利组TM蛋白表达量均增加（P＜0.05）；与卡托普利组比较，络风宁1号组TM蛋白表达量下降但无统计学差异（P＞0.05），模型组TM蛋白表达量下降（P＜0.05），假手术组、联合用药TM蛋白表达量增加但无统计学差异（P＞0.05），表2。

2.3 各组大鼠血清sEPCR、sTM、APC含量比较

与假手术组相比，其余各组血清 sEPCR、sTM含量均增高（P＜0.05）；与模型组比较，其余各组血清sEPCR、sTM含量均降低（P＜0.05）；与卡托普利组比较，假手术组血清sEPCR、sTM含量降低（P＜0.05），联合用药组血清sEPCR、sTM含量降低但无统计学意义（P＞0.05），模型组、络风宁1号组血清sEPCR、sTM含量升高（P＜0.05），表3。

表1 各组大鼠心肌梗死边缘区组织EPCR及TM的mRNA表达结果（±s）

表1 各组大鼠心肌梗死边缘区组织EPCR及TM的mRNA表达结果（±s）

注：EPCR：内皮细胞蛋白C；TM：血栓调节蛋白；与假手术组相比，aP＜0.05；与模型对照组相比，bP＜0.05；与卡托普利组相比，cP＜0.05

假手术组 7 1.4 2±0.9 2 0.9 6±0.3 9模型组 8 1 6 7.6 1±2 9.3 0 ac 3 7.3 0±4.1 4 ac络风宁1号组 7 7 5.6 1±1.6 3 abc 4.5 2±0.2 2 abc联合用药组 8 5.7 1±2.5 7 ab 1.5 9±0.8 8 b卡托普利组 8 5.8 0±3.5 4 b 2.1 0±0.8 4 b

表2 各组大鼠心肌组织EPCR、TM蛋白Western Blot条带灰度分析结果（ ±s）

表2 各组大鼠心肌组织EPCR、TM蛋白Western Blot条带灰度分析结果（ ±s）

注：EPCR：内皮细胞蛋白C；TM：血栓调节蛋白；与假手术组相比，aP＜0.05，与模型对照组相比，bP＜0.05；与卡托普利组相比，cP＜0.05

组别 例数 EPCR平均灰度 TM平均灰度假手术组 7 0.84±0.05 0.85±0.12模型组 8 0.61±0.08ac 0.55±0.12ac络风宁1号组 7 1.03±0.05ab 0.83±0.06联合用药组 8 1.04±0.12ab 0.88±0.19b卡托普利组 8 1.04±0.08ab 0.85±0.23b

与假手术组比较，模型组血清APC含量降低（P＜0.05），其余各组均降低但无统计学差异（P＞0.05）；与模型组相比，其余各组血清APC含量均升高（P＜0.05）；与卡托普利组比较，络风宁1号组血清APC含量降低但无统计学差异（P＞0.05）、模型组血清APC含量降低（P＜0.05），联合用药组、假手术组血清APC含量升高但无统计学意义（P＞0.05），表3。

3 讨论

血栓调节素（TM）是血管内皮细胞表面的凝血酶受体之一，TM与凝血酶结合后引起凝血酶结构改变，形成的复合物可加速激活蛋白C形成活化蛋白C（APC），APC能够与纤维蛋白溶解酶原活化抑制剂1形成复合物，促进纤维蛋白溶解酶原活化，同时还可以通过刺激纤溶酶原释放而起到促纤溶活性的作用[5]。APC还可以直接抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）及核转录因子kB（NF-kB）亚基p50和p52的表达，另有相关研究发现APC通过抑制Caspase-3的活性，抑制Ca2+超载引起的细胞及线粒体依赖的细胞凋亡间接发挥抗炎作用[6,7]。EPCR是I型血管内皮细胞跨膜糖蛋白，目前有研究证实EPCR可促进蛋白C呈递给TM-凝血酶复合物，使得APC在体内活化效率提高约数十倍[8]，APC与EPCR结合后可以抑制中性粒细胞粘附分子CD11b/CD18的表达发挥抗炎作用[9]，同时还可以在蛋白S辅助下灭活因子Va和因VⅢa，发挥抗凝作用[10]。

表3 各组大鼠血清EPCR、TM、APC含量结果（ ±s，pg/ml）

表3 各组大鼠血清EPCR、TM、APC含量结果（ ±s，pg/ml）

注：EPCR：内皮细胞蛋白C；TM：血栓调节蛋白；APC：活化蛋白C；与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与卡托普利组相比，cP＜0.05

络风宁1号方中徐长卿、地龙为君药，共奏祛风通络之功；三七为臣药，散瘀止痛；冰片佐药，清热止痛、调和诸药；诸药相合以祛风通络为主，整体调节脏腑功能，标本兼顾。本研究结果显示络风宁1号方能够减轻膜结合型EPCR、TM的损伤，抑制了TM、EPCR的mRNA代偿性增加，使sEPCR、sTM含量下降，APC含量增加，上调心肌组织中EPCR、TM的蛋白表达，并且较模型组有统计学意义，说明络风宁1号方能够刺激TM、EPCR的合成，增加APC产生，逆转凝血酶活性，并减少sTM、sEPCR的产生，从而增加APC的有效作用，使TM-APC-EPCR系统良好的整合从而提高内皮细胞抗凝及抗炎作用，且络风宁1号方联合卡托普利具有协同增效的作用。后期课题组将进一步完善哪些信号通路参与TMAPC-EPCR系统作用调节，络风宁1号方治疗该系统在心肌梗死疾病中的变化仍需要进一步验证，从而为临床治疗和预后提供可靠依据。

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Regulative effect of Luofengning Fang I on system of thrombomoduline-activated protein C-endothelial protein C receptor in rats with myocardial infarction

Sun Tian*, Wang Xian.
*Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China.
Corresponding author: Wang Xian, E-mail: wx650515@163.com

ObjectiveTo investigate the regulative effect of Luofengning Fang I on system of thrombomoduline

activated protein C-endothelial protein C receptor (TM-APC-EPCR) in rats with myocardial infarction (MI).MethodsSD rats were randomly divided into sham-operation group (n=7), model group (n=8), Luofengning Fang I group(n=7), combined therapy group (n=8) and captopril group (n=8). After modeling of MI, Luofengning Fang I group and combined therapy group were given decoction of Luofengning Fang I [contained 4.81 g/(kg. d) of crude medicinal],captopril group and combined therapy group were given captopril tablets [7.5 mg/(kg. d)], and sham-operation group and model group were the same volume of distilled water twice a day for 4 weeks. The gene and protein expressions of TM, APC and EPCR in peripheral tissue of MI were detected in all groups after 4 weeks.ResultsThe levels of EPCR-mRNA, TM-mRNA, serum EPCR (sEPCR) and serum TM (sTM) increased significantly (P＜0.05), and protein expressions of EPCR and TM and APC level decreased (P＜0.05) in model group compared with sham-operation group.The levels of EPCR-mRNA and TM-mRNA decreased (P＜0.05), and protein expression of EPCR increased (P＜0.05)in Luofengning Fang I group and combined therapy group compared with model group. The level of serum APC increased in Luofengning Fang I group and combined therapy group compared with model group (P＜0.05).ConclusionLuofengning Fang I can relieve the injury of EPCR and TM, inhibit compensatory increases of TM-mRNA and EPCR-mRNA, reduce levels of sEPCR and sTM, and improve APC level.

Myocardial infarction; Luofengning Fang I; Thrombomoduline; Activated protein C; Endothelial protein C receptor; Rats

R542.22

A

1674-4055(2017)11-1342-04

北京中医药大学自主选题项目(2014-JYBZZ-XS-133)

1110032 沈阳,辽宁中医药大学附属医院;2100700北京,北京中医药大学东直门医院

王显,E-mail:wx650515@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.11.14

杨新颖，姚雪莉