N-乙酰半胱氨酸预防硝酸酯耐药的实验效果及机制探讨

陈良，蒋锦琪，冯辉，张颖

N-乙酰半胱氨酸预防硝酸酯耐药的实验效果及机制探讨

陈良1，蒋锦琪1，冯辉1，张颖1

目的通过建立单硝酸异山梨醇酯（ISMN）耐药动物模型，观察N-乙酰半胱氨酸（NAC）对预防硝酸酯耐药的实验效果，分析相关机制。方法取成年雄性新西兰大白兔32只，体质量（2500±200）g，随机分为对照组、常规组、耐药组和NAC组，每组8只。对照组不予用药；常规组经胃管灌服ISMN 25 mg，1/d；耐药组灌服ISMN 25 mg，1/12 h；NAC组同时灌服ISMN 25 mg和NAC 100 mg，1/12 h。7 d后处死所有实验兔，取腹主动脉，每5 mm剪为数段，分别检测血管环舒张反应以及血管组织总巯基（T-SH，微量酶标法）、超氧阴离子（O2-，化学比色法）、超氧化物歧化酶（SOD，黄嘌呤氧化酶法）、丙二醛（MDA，硫代巴比妥酸法）、内皮素-1（ET-1，双抗体夹心法）和亚硝酸盐（NO2-，硝酸还原酶法）水平。结果随着硝酸甘油（GTN）浓度的递增，各组腹主动脉血管环的舒张幅度都呈现不同程度的增加。耐药组血管环的舒张幅度均明显小于其他3组，差异有统计学意义（P均＜0.01）；而对照组、常规组和NAC组之间的差异无统计学意义（P均＞0.05）。当GTN浓度增至10-4mol/L时，对照组、常规组和NAC组的舒张幅度分别达到（98.91±1.99）%、（95.59±3.97）%和（93.18±6.36）%；而耐药组仅达到（63.62±6.03）%，明显低于其他3组。T-SH含量和SOD活力由高到低依次为对照组、NAC组、常规组和耐药组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与之相反，O2-、MDA、ET-1和NO2-含量由高到低则依次为耐药组、常规组、NAC组和对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论口服NAC可通过增加血管组织的巯基含量、抑制ISMN诱发的氧化应激和缩血管物质的生成来预防硝酸酯的耐药性，进而充分发挥其扩血管效应。

N-乙酰半胱氨酸；硝酸酯耐药；5-单硝酸异山梨醇酯；巯基；氧化应激；兔

1879年英国医生Willian Murrell首次报道硝酸甘油可有效缓解心绞痛，至今已研发出包括硝酸甘油（GTN）、二硝酸异山梨醇酯（ISDN）、5-单硝酸异山梨醇酯（ISMN）和戊四硝酸醇酯（PETN）等一系列硝酸酯类药物，并被广泛应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、充血性心力衰竭、高血压病等心血管疾病的治疗。然而硝酸酯耐药是困扰其临床使用的主要问题。以往对硝酸酯耐药的认识大多基于GTN注射剂或贴剂的研究，而对于口服ISMN的研究则较少。Oelze等[1]曾通过动物研究发现应用ISMN同样可引起血管内皮功能损伤、氧化应激和内皮素-1的生成而诱发耐药。而N-乙酰半胱氨酸（NAC）为活性巯基（-SH）的载体、还原型谷胱甘肽（GSH）的前体，具有显著的抗氧化作用，能清除自由基、保护酶活性[2]。因此，本研究尝试采用ISMN建立硝酸酯耐药的动物模型，观察口服NAC对硝酸酯耐药的预防作用并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、材料与试剂

MPA 2000离体实验系统、ALC-M恒温组织浴槽由上海奥尔科特生物科技有限公司生产。抗超氧及产生超氧阴离子自由基（·O2-）测试盒（20140114）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（20140115）、丙二醛（MDA）测试盒（20140117）、一氧化氮（NO）试剂盒（20131231）和微量总巯基（T-SH）（A063）测试盒购于南京建成生物工程研究所，内皮素-1（ET-1）放射免疫分析药盒（S20083014，北京北方生物技术研究所），乙酰半胱氨酸颗粒（H20000472，海南赞邦制药有限公司），单硝酸异山梨醇酯缓释胶囊（H20031224，优时比制药有限公司），硝酸甘油注射液（H11020291，北京益民药业有限公司）。K-H溶液配方：NaCl 130 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.17 mmol/L、KH2PO41.18 mmol/L、NaHCO314.9 mmol/L、CaCl21.6 mmol/L、Glucose 5.5 mmol/L、EDTA 0.026 mmol/L。

1.2 动物分组与用药

取雄性新西兰大白兔（由上海杰思捷实验动物有限公司提供）32只，体质量（2500±200）g，随机分为4组：对照组、常规组、耐药组和NAC组，每组各8只。对照组普通饲养，不予用药；常规组每日固定时间经胃管灌服ISMN（取胶囊内小丸）25 mg，1/d，7 d；耐药组于每日固定时间以同样方法灌服ISMN 25 mg，1/12 h，共7 d；NAC组则于每日固定时间同时灌服ISMN 25 mg和NAC 100 mg，1/12 h， 共7 d。

1.3 取材与组织生化测定

干预7 d后处死所有实验兔，取出由肾动脉远端至髂总动脉近端的腹主动脉段，将其剪成若干段，每段5 mm，其中1段用以血管环舒张反应检测，其余各段分别通过相应的试剂盒进行组织T-SH（微量酶标法）、·O2

-（化学比色法）、SOD（黄嘌呤氧化酶法）、MDA（硫代巴比妥酸法）、NO2-（硝酸还原酶法）和ET-1（双抗体夹心ABC-ELISA法）测定，操作过程和计算方法严格按照各试剂盒说明书进行。

1.4 血管环舒张反应检测

分别取各组实验兔的5 mm长血管1段，一端与肌力传感器相连，悬挂于盛有10 ml K-H溶液的ALC-M恒温组织浴槽中（温度37℃，pH=7.4），另一端施加2 g负荷，连续通入含95%·O2+5%CO2的混合气体，平衡2 h，期间每30 min更换K-H溶液一次。平衡后通过MPA 2000离体实验系统记录血管环静息张力值和收缩舒张曲线，继而加入10-5mol/L的苯肾上腺素100 μL，使血管环激动收缩，当其收缩最大张力值并在舒张反应稳定后依次加入10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L的GTN注射液，观察记录血管环的张力值，最后计算不同组别血管的舒张幅度百分比=（最大张力值－不同浓度GTN时的张力值）/（最大张力值－静息张力值）×100%。

1.5 统计学处理

采用SAS 8.1软件包进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数的比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管环舒张反应

随着GTN浓度的递增，各组腹主动脉血管环的舒张幅度都呈现不同程度的增加。耐药组血管环的舒张幅度均明显小于其他三组，差异有统计学意义（P均＜0.01）；而对照组、常规组和NAC组之间的差异无统计学意义（P均＞0.05）。当GTN浓度增至10-4 mol/L时，对照组、常规组和NAC组的舒张幅度分别达到（98.91±1.99）%、（95.59±3.97）%和（93.18±6.36）%；而耐药组仅达到（63.62±6.03）%，明显低于其他三组，表1。

2.2 血管组织生化检测结果

所有血管组织的生化检测指标中，T-SH含量和SOD活力由高到低依次为对照组、NAC组、常规组和耐药组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与之相反，·O2-、MDA、ET-1和NO2-含量由高到低则依次为耐药组、常规组、NAC组和对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05），表2。

3 讨论

硝酸酯是非内皮依赖性的血管扩张剂，进入血管平滑肌细胞后，通过释放NO刺激鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷（cGMP）浓度增加，降低细胞内的Ca2+浓度，导致血管平滑肌舒张。在连续使用硝酸酯后发生的血液动力学和抗缺血效应迅速减弱至消失的现象称之为硝酸酯耐药。随着1888年美国医生Stewart首次报道硝酸甘油耐药以来，人们对硝酸酯耐药的机制进行了广泛的研究却仍无定论。目前根据硝酸酯耐药机制不同可分为[3]：①假性耐药（神经激素激活）：多发生于短期（1 d）连续使用后，可能与交感-肾素-血管紧张素-醛固酮系统等神经激素的反向调节和血管容量增加有关；②真性耐药（血管性耐药）：长期（3 d以上）应用硝酸酯后引起血管自身结构和功能改变而产生耐药；③交叉性耐药：一种硝酸酯抑制或削弱其他硝酸酯或NO供体性血管扩张剂及内源性NO等的作用。后二者的发生多与巯基耗竭、氧化应激等因素有关。

表1 不同浓度GTN时各组血管环的舒张幅度（%，n=8）

表2 各组实验兔血管环生化检测结果比较（n=8）

如何预防硝酸酯耐药的发生，目前依然是个医学难题，虽然做出了众多尝试[4-8]，如联合使用卡维地洛、血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物、肼苯哒嗪、维生素C、维生素E、叶酸、ET-1受体阻滞剂等，具有一定效果但仍不尽如人意[9]。虽然目前常采用间隙或偏心给药来预防硝酸酯耐药[3]，但仍无法实现对心血管的24 h全程保护。探索一种新的即可以改善硝酸酯耐药又可以充分发挥其扩血管效应的手段将成为解决硝酸酯耐药的新方法，国外研究显示鸟苷酸环化酶激活物BAY 60-2770可以部分改善血管内皮细胞功能，增加血管NO水平来改善硝酸酯耐药[10]；松弛素可以通过减轻氧化应激反应，升高乙醛脱氢酶来发挥保护内皮细胞，减轻或逆转硝酸酯耐药的效应[11,12]。NAC作为一种含有巯基的抗氧化剂在呼吸系统、心血管系统及神经系统均具有重要的临床价值，但其在改善硝酸酯耐药性方面的研究还较少。

本研究采用每12 h给予ISMN的方式诱发硝酸酯耐药。通过检测各组实验兔血管环在不同浓度GTN作用下的舒张反应显示，虽然各组血管均随着GTN浓度的递增而呈现舒张幅度的增加，但耐药组的舒张幅度明显低于对照组和常规组，这不仅证实了ISMN所致硝酸酯耐药模型的确立，同时也提示了血管对GTN交叉耐药的存在；而NAC组的舒张幅度明显高于耐药组，甚至接近于对照组和常规组，证明NAC能改善血管环的舒张活性、抑制硝酸酯耐药的产生。在进行组织生化检测后发现，服用硝酸酯的3组（以下合称用药3组）兔血管中T-SH含量及SOD活力均低于对照组，但NAC组T-SH含量及SOD活力高于耐药组，这表明硝酸酯类药物的应用导致了血管组织-SH的消耗，且随着用药间隔的缩短致-SH消耗更为严重。NAC可以外源性补充活性-SH有效弥补血管组织中-SH的缺失，进而促进GSH的生成，清除H2O2恢复SOD活性。研究还发现，用药3组的·O2-和MDA含量均显著高于对照组，耐药组O2-和MDA含量最高，提示硝酸酯的应用诱发了组织氧化应激的形成，导致·O2-生成增多，继而诱发脂质过氧化产生MDA，且随着用药间隔的缩短更加剧了氧化应激的程度，NAC可以通过恢复SOD活力，清除·O2-，减少MDA生成来减轻硝酸酯所带来的负面效应。结果中还显示各组ET-1含量的变化与·O2-、MDA的变化平行，其间原因可能是氧化应激的存在和程度决定了ET-1含量的高低。

此外，由于目前尚无法直接测定组织中的NO含量，仅能通过测定其转化产物NO2-/ NO3-以间接反映NO水平。本研究发现用药3组的NO2-含量均高于对照组，尤以耐药组最高，所以ISMN的生物转化并未由于缩短用药间隔而受到抑制，且其代谢产物随着用药频次增加而增多。而所测NAC组的NO2-却明显低于耐药组，甚至还略低于常规组，可能由于外源性-SH的补充加强了GSH的抗氧化活性，抑制了NO氧化为NO3-/ NO2-，故而未能被有效检测到，因而出现NAC组NO2-含量较低而血管舒张反应却反而加强的现象。

综前所述，本研究发现NAC可能通过提高血管组织-SH含量而有效抑制硝酸酯诱发的氧化应激，恢复SOD活性、清除·O2-及其氧化产物、减少缩血管物质的生成来改善血管的舒张功能，抑制或延缓硝酸酯耐药的产生，从而更有效、更持久地发挥硝酸酯的扩血管和抗心肌缺血作用。但NAC是否能通过抑制NO氧化而延长其作用时间和效能，有待进一步研究。

[1]Oelze M,Knorr M,Kroller-Schon S,et al. Chronic therapy with isosorbide-5-mononitrate causes endothelial dysfunction, oxidative stress, and a marked increase in vascular endothelin-1 expression[J].Eur Heart J,2013,34(41):3206-16.

[2]Elbini Dhouib I,Jallouli M,Annabi A,et al. A minireview on N-acetylcysteine: An old drug with new approaches[J]. Life Sci,2016,151:359-63.

[3]中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会. 硝酸酯在心血管疾病中规范化应用的专家共识[J]. 中华全科医师杂志,2012,11(10):725-8.

[4]Daiber A,Münzel T. Organic Nitrate Therapy, Nitrate Tolerance, and Nitrate-Induced Endothelial Dysfunction: Emphasis on Redox Biology and Oxidative Stress[J]. Antioxid Redox Signal,2015,23(11):899-942.

[5]Münzel T,Steven S,Daiber A. Organic nitrates: update on mechanisms underlying vasodilation, tolerance and endothelial dysfunction[J].Vascul Pharmacol,2014,63(3):105-13.

[6]Münzel T,Gori T. Nitrate therapy and nitrate tolerance in patients with coronary artery disease[J]. Curr Opin Pharmacol,2013,13(2):251-9.

[7]Thadani U. Challenges with nitrate therapy and nitrate tolerance:prevalence, prevention, and clinical relevance[J]. Am J Cardiovasc Drugs,2014,14(4):287-301.

[8]谢永花,白雪,杨思进. 硝酸酯类药物耐药机制及临床应对策略研究进展[J]. 实用心脑肺血管病杂志,2015,23(7):47-50.

[9]Münzel T,Daiber A,Gori T. More answers to the still unresolved question of nitrate tolerance[J]. Eur Heart J,2013,34(34):2666-73.

[10]Jabs A,Oelze M,Mikhed Y,et al. Effect of soluble guanylyl cyclase activator and stimulator therapy on nitroglycerin-induced nitrate tolerance in rats[J]. Vascul Pharmacol,2015,16(s1):1-2.

[11]Hu XY,Fang Q,Ma D,et al. Aldehyde dehydrogenase 2 protects human umbilical vein endothelial cells against oxidative damage and increases endothelial nitric oxide production to reverse nitroglycerintolerance[J].Genet Mol Res,2016,15(2):7822.

[12]Leo CH,Fernando DT,Tran L,et al. Serelaxin Treatment Reduces Oxidative Stress and Increases Aldehyde Dehydrogenase-2 to Attenuate Nitrate Tolerance[J]. Front Pharmacol,2017,8:141.

Experimental effect and mechanism of N-acetylcysteine in preventing nitrate resistance

Chen Liang*,Jiang Jinqi, Feng Hui, Zhang Ying.
*Emergency Department, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030, China.
Corresponding author: Jiang Jinqi, E-mail: 123jiangjq@sina.com

ObjectiveTo observe the experimental effect of N-acetylcysteine (NAC) in preventing nitrate resistance and analyze relevant mechanism through establishing an animal model of isosorbide-5-mononitrate(ISMN) resistance.MethodsMale adult New Zealand rabbits (n=32) with body mass=(2500±200) g were randomly divided into control group, routine group, drug-resistance group and NAC group (each n=8). The control group was not given any drugs, routine group was intragastrically given ISMN (25 mg/time) once a day, drugresistance group, ISMN (25 mg/time) once every 12 h, and NAC group, ISMN (25 mg/time) and NAC (100 mg) once every 12 h. All rabbits were executed after 7 d and the abdominal aorta was collected and cut into segments (5 mm) for detecting vascular ring relaxation response, and levels of total sulfhydryl (T-SH, micro enzyme standard method), superoxide anion (O2-, chemical colorimetry), superoxide dismutase (SOD, xanthine oxidase method),malondialdehyde (MDA, thiobarbituric acid method), endothelin-1 (ET-1, double antibody sandwich method),and nitrite (NO2-, nitric acid reductase method).ResultsAs the concentration of nitroglycerin (GTN) increased progressively, vascular ring relaxation amplitude of abdominal aorta increased in varying degrees in all groups. The vascular ring relaxation amplitude was lower in drug-resistance group than that in other 3 groups (all P＜0.01), and the difference among control group, routine group and NAC group had no statistical difference (all P＞0.05). When the concentration of GTN increased to 10-4mol/L, the vascular ring relaxation amplitude reached to (98.91±1.99)% in control group, (95.59±3.97) % in routine group, (93.18±6.36) % in NAC group, and only (63.62±6.03) %in drug-resistance group. The level of T-SH and SOD vitality showed a descending order in control group, NAC group, routine group and drug-resistance group (all P＜0.05). While the levels of O2-, MDA, ET-1 and NO2-showed a descending order in drug-resistance group, routine group, NAC group and control group (all P＜0.05).ConclusionOrally administrated NAC can prevent nitrate resistance and exert the effect of vascular dilation through increasing sulfhydryl level and inhibiting oxidative stress and generation of vasoconstrictive substance induced by ISMN.

N-acetylcysteine; Nitrate resistance; Isosorbide-5-mononitrate; Sulfhydryl; Oxidative stress; Rabbits

R541

A

1674-4055(2017)11-1334-04

中国医师协会探索心血管研究基金(DFCMDA201431)

1200030 上海,上海交通大学附属胸科医院急诊科

蒋锦琪,E-mail:123jiangjq@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.11.12

姚雪莉